高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量

謝紫薇，李 強(qiáng)，劉 姍

（1.四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610500； 2.攀枝花學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量

謝紫薇1，李 強(qiáng)2，劉 姍2

（1.四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610500； 2.攀枝花學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

目的 建立同時測定芒果葉中蘆丁、槲皮素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 采用色譜柱Inertsil ODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 m)進(jìn)行分析，流動相為70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脫，體積流量為1.0 mL／min，檢測波長為368 nm，柱溫為35℃。結(jié)果 蘆丁、槲皮素質(zhì)量濃度均在1.464 48～120 g／mL（R2＝0.999 8，R2＝0.999 5）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；平均回收率分別為100.08%和99.93%，RSD分別為1.12%和0.92%(n＝6）。結(jié)論 該方法可用于芒果葉的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；芒果葉；蘆丁；槲皮素

芒果葉為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的干燥葉[1]，其味酸、甘，性涼、平，具有行氣疏滯、去痧積的功能，主要用于治療熱滯腹痛、氣脹、小兒疳積、消渴等癥[2]。現(xiàn)代研究表明，芒果葉提取物具有平喘、止咳、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3－4]，芒果葉中含有槲皮素、蘆丁、抗壞血酸、鞣質(zhì)、芒果苷、高芒果苷、異芒果苷、沒食子酸等多種化學(xué)成分[3，5－6]。目前關(guān)于芒果葉化學(xué)成分含量測定的研究報(bào)道較少，僅見芒果苷、高芒果苷、沒食子酸、總黃酮、多糖、多酚等的測定[7－12]。本研究中查閱文獻(xiàn)[13－16]，建立了同時測定芒果葉中槲皮素與蘆丁含量的高效液相色譜（HPLC）法，方法簡便、準(zhǔn)確，進(jìn)一步完善了芒果葉的質(zhì)量控制體系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元泵（G1311A）、自動進(jìn)樣器 （G1313A）、柱溫箱（G1316A）、VWD檢測器（G1314A）、Agilent 1200 series色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；FA2240B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SB120D型超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ－200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（南京予凱儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海青浦瀘西儀器廠）；202型電熱恒溫干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；純化水系統(tǒng)（成都吉尼水處理設(shè)備研究所）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為10081－200501）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為10080－200707）；芒果葉采自攀枝花學(xué)院校園，經(jīng)攀枝花學(xué)院劉姍副教授鑒定為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的葉。甲醇，磷酸（成都長聯(lián)化工試劑有限公司）均為色譜純；高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：InertsilODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脫；體積流量：1.0 mL／min；檢測波長：368 nm；柱溫：35℃。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取蘆丁3.0 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，標(biāo)為①；從①中量取10 mL，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋并定容至刻度，標(biāo)為②；同法依次配得溶液③～⑦。槲皮素對照品溶液同法配制。

供試品溶液：稱取芒果葉樣品粉末(過3號篩)0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(200 W，45 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：在擬訂色譜條件下，將不同質(zhì)量濃度對照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，以對照品質(zhì)量濃度(X，μg／mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為蘆丁 Y＝17.787 X－8.595 4(R2＝0.9998)，槲皮素 Y＝65.207X－18.631(R2＝0.999 5)。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮素質(zhì)量濃度在1.46448～120μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液10 μL，注入色譜儀，在擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為 0.27%和0.21%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾后，分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣10 μL，在擬訂色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為0.49%和0.72%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一芒果葉樣品粉末6份，每份約3.0 g，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣10 μL。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為0.21%和0.23% (n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的芒果葉樣品粉末6份，每份約 0.25 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁(37.75 μg／mL)對照品溶液1 mL、槲皮素(50.54 μg／mL)對照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

稱取3批芒果葉樣品粉末，每批3份，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測定。結(jié)果見表2。

3 討論

在優(yōu)化芒果葉藥材提取條件時，分別對提取方式（回流提取和超聲提取）、提取時間、提取溶劑進(jìn)行了考察。分別以20，40，60，80 min進(jìn)行回流提取和超聲提取。結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，芒果葉樣品中2種成分的含量逐漸增大，但 60 min后逐漸呈下降趨勢，從節(jié)約角度出發(fā)，最終確定以超聲提取 60 min為最佳。在提取溶劑的考察中，分別考察了2，4，6，8，10倍量體積的水和甲醇，結(jié)果表明，10倍量的甲醇提取效果最佳。

表2 樣品中蘆丁和槲皮素含量測定結(jié)果（n＝3，mg／g）

蘆丁、槲皮素經(jīng)過紫外吸收波長測定后，分別以355，365，368 nm作為HPLC檢測波長并進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在368 nm波長下，2種物質(zhì)的檢測靈敏度均較高，因此選擇368 nm作為檢測波長。

色譜條件優(yōu)化時，分別考察了甲醇和乙腈作為色譜流動相有機(jī)相，結(jié)果顯示，有機(jī)相為甲醇時，基線較平，干擾較小；考察了純水、乙酸、甲酸、磷酸、磷酸緩沖溶液作為流動相水相，結(jié)果顯示，磷酸可以顯著提高分離效果，但過多的磷酸加入會明顯增高基線。最終選擇70%甲醇－0.1%磷酸（65∶35）為組成的流動相系統(tǒng)。經(jīng)多次調(diào)整梯度洗脫程序，最終采用本研究中的梯度洗脫程序，能使所檢測的芒果葉樣品中這2種成分的色譜峰達(dá)到基線分離，峰形均較好，且分離度高。

芒果葉尚未被《中國藥典》收載，目前收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]，尚無含量檢測項(xiàng)。為進(jìn)一步提升芒果葉的質(zhì)量控制水平，有必要對芒果葉的主要有效成分進(jìn)行測定。蘆丁、槲皮素屬黃酮類，均具有較好的生物活性，本研究中建立的方法可同時對以上2種成分進(jìn)行分析，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，補(bǔ)充了現(xiàn)有文獻(xiàn)對芒果葉化學(xué)成分含量測定的不足，可用于芒果葉的質(zhì)量控制。下一步，可繼續(xù)對芒果葉其余有效成分的測定進(jìn)行研究，有助于更全面地控制芒果葉藥材的質(zhì)量。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海人民衛(wèi)生出版社，1977:1 040.

[2]廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992:54.

[3]鄧家剛，曾春暉.芒果葉及芒果苷30年研究概況[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，6(2):44.

[4]劉雪萍，蔣偉哲，黃興振，等.芒果葉提取物體外抗菌作用研究[J].中國藥業(yè)，2007，16（9）:12－13.

[5]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(下冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1983：306.

[6]黃鎖義，黎海妮，唐玉蓮，等.超聲波提取芒果葉黃酮[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23(6):455－456.

[7]馮 旭，王勝波，鄧家剛，等.高效液相色譜法同時測定芒果葉中芒果苷與高芒果苷的含量[J].中成藥，2008，30（10）: 1 504－1 506.

[8]侯小濤，戴 航，周麗霞.RP－HPLC測定4個品種芒果葉中的沒食子酸[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（1）:128.

[9]王曉波，劉冬英，鄒志輝，等.芒果葉總黃酮含量及抗氧化作用測定[J].中國公共衛(wèi)生，2013，29（7）:1 016－1 018.

[10]李金花，農(nóng)石生，韋柳培，等.芒果葉多糖的提取及含量測定[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（3）:135－137.

[11]文良娟，王 維，王 斌，等.芒果葉中黃酮和多酚含量及抗氧化性研究[J].食品工業(yè)，2013（1）:144－147.

[12]鄧家剛，馮 旭，王 勤，等.不同產(chǎn)地及不同品種芒果葉中芒果苷的含量對比研究[J].中成藥，2006，28（12）:1 755－1 756.

[13]王明星，于秀華，李煥榮，等.高效液相色譜法測定痔速寧膠囊中蘆丁含量[J].中國藥業(yè)，2006，15(8)：28.

[14]陽 華，王文淵，蔣小玲.反相高效液相色譜法測定心可舒顆粒中葛根素和蘆丁含量[J].中國藥業(yè)，2012，21（15）: 37－38.

[15]項(xiàng)貴賢 .反相高效液相色譜法測定金蕎麥片中槲皮素含量[J].中國藥業(yè)，2010，19(23）：29－30.

[16]陳 健.高效液相色譜法測定金錢草片中槲皮素和山柰素含量[J].中國藥業(yè)，2016，25（6）:62－63.

Simultaneous Content Determination of Rutin and Quercetin in Folium M angiferae by HPLC

Xie Ziwei1,Li Qiang2,Liu Shan2
(1.Xindu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,China 610500; 2.Panzhihua University,Panzhihua,Sichuan,China 617000)

Objective To establish an HPLC method forthesimultaneouscontent determination of rutin and quercetin in Folium Mangiferae.M ethods The analysis was performed on Inertsil ODS－2 column (150 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase was 70% methanol－0.2% phosphoric(65∶35)with lsocratic elution,flow rate was 1.0 mL／min,detection wavelength was set at 368 nm,and column temperature was maintained at 35℃.Results The linear ranges of rutin and quercetin were 1.464 48－120 μg／mL(R2＝0.999 8,R2＝0.999 5),respectively.Their average recovery rateswere 100.08%(RSD＝1.12%,n＝6)and 99.93%(RSD＝0.92%, n＝6),respectively.Conclusion This method can be used for the quality control of Folium Mangiferae.

HPLC;folium mangiferae;rutin;quercetin

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2016)21－0034－03

謝紫薇（1981－），女，碩士研究生，高級工程師，主要從事中藥制劑質(zhì)量評價研究，（電子信箱）657064681＠qq.com；劉姍（1980－），女，博士研究生，副教授，主要從事藥用植物有效成分提取及藥用植物分子生物學(xué)及基因工程研究，本文通訊作者，（電子信箱）9549057＠qq.com。

2016－06－11；

2016－07－07)