鹽酸伊立替康注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

王婷婷，李 亙，周 瑞

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 連云港 222006； 2.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 連云港 222006）

鹽酸伊立替康注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

王婷婷1，李 亙1，周 瑞2

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 連云港 222006； 2.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 連云港 222006）

目的 建立鹽酸伊立替康注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。方法 依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法的要求，通過(guò)預(yù)干擾和干擾試驗(yàn)確定樣品最大無(wú)干擾濃度，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果 樣品用堿性調(diào)節(jié)稀釋劑Ⅱ調(diào)節(jié)樣品pH至6.0～7.0，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BET)用水稀釋至0.95 g／L時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無(wú)干擾作用。結(jié)論 該方法用于檢查鹽酸伊立替康注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素可行。

鹽酸伊立替康注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；凝膠法；干擾試驗(yàn)

鹽酸伊立替康是半合成喜樹(shù)堿衍生物類(lèi)抗腫瘤藥物，能特異性抑制DNA拓?fù)錁?gòu)型異構(gòu)酶Ⅰ，從而阻礙DNA的合成，具有水溶性好、毒副作用小、廣譜抗癌等特點(diǎn)，被認(rèn)為是近年來(lái)最有前途的抗癌藥物。其制劑于1994年在日本進(jìn)入臨床，2001年3月在中國(guó)上市，主要用于成人大腸癌復(fù)發(fā)和惡化的一線(xiàn)治療，并對(duì)小細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等有一定療效[1－2]。2015年版《中國(guó)藥典》尚未收載該品種，在目前執(zhí)行的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中仍采用熱原檢查法，結(jié)果獲得較慢，易受家兔干擾而出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。為了提高該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3]，并參考文獻(xiàn)[4－7]對(duì)鹽酸伊立替康注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了可行性研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MET－50型智能恒溫加熱儀（天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸伊立替康注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)分別為16030138，16031938，16051938，規(guī)格為每支5 mL∶100 mg）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為150601－201580，規(guī)格為每支80 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 160006－201510，規(guī)格為每支5 mL）；堿性調(diào)節(jié)稀釋劑Ⅱ（湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)為1507300）；鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，標(biāo)示靈敏度為0.25 EU／mL，批號(hào)為1508240，標(biāo)示靈敏度為0.125 EU／mL，批號(hào)為1510135；湛江安度斯生物科技有限公司，標(biāo)示靈敏度為0.25 EU／mL，批號(hào)為 1509251，標(biāo)示靈敏度為 0.125 EU／mL，批號(hào)為1511172）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET用水溶解，配置成2.0 λ，1.0 λ，0.5 λ，0.25 λ的溶液，按《中國(guó)藥典》[3]操作，以BET用水做2支陰性對(duì)照（NC），對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行標(biāo)示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見(jiàn)表1。4批鱟試劑靈敏度均在0.5 λ～2.0 λ范圍內(nèi)，均符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.2 內(nèi)毒素限值（L）的計(jì)算

根據(jù)公式L＝K／M[3]，注射劑K＝5 EU／（kg·h）。M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大劑量，根據(jù)藥品說(shuō)明書(shū)推薦劑量為350 mg／m2，人均體質(zhì)量劑量注射時(shí)間不足1 h按1 h計(jì)，供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即轉(zhuǎn)換為每千克體質(zhì)量劑量，M＝350×0.027＝9.45（mg／kg），則L＝5／9.45＝0.529 EU／mg。為保障安全用藥，將本品的限值設(shè)為每1 mg鹽酸伊立替康注射液中含內(nèi)毒素應(yīng)小于0.264 EU。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式 MVD＝C×L／λ[3]，L為供試品的內(nèi)毒素限值0.264 EU／mg，C等于20 g／L，以市售凝膠法最高靈敏度 0.03 EU／mL為基準(zhǔn)，MVD＝C×L／λ＝（20 g／L×0.264 EU／mg）／0.03 EU／mL＝176。

2.4 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

取3批鹽酸伊立替康注射液，用堿性調(diào)節(jié)稀釋劑II調(diào)節(jié)樣品pH至6.0～7.0，再用BET用水稀釋成1.89， 0.95，0.47，0.23，0.11 g／L作為供試品系列（NPC），同時(shí)每個(gè)稀釋度下均制備含有2 λ濃度細(xì)菌內(nèi)毒素的溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照系列（PPC）。用λ為0.25 EU／mL的2個(gè)廠家的鱟試劑分別與2個(gè)系列溶液反應(yīng)，每個(gè)稀釋度作2支。另取2支加入 BET用水作陰性對(duì)照（NC），2支加入2 λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照（PC），結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，鹽酸伊立替康質(zhì)量濃度在0.95 g／L時(shí)，對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)無(wú)明顯干擾抑制作用。

表2 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 正式干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，取3個(gè)批號(hào)的鹽酸伊立替康注射液，用堿性調(diào)節(jié)稀釋劑Ⅱ調(diào)節(jié)樣品 pH至6.0～7.0，用BET用水稀釋成0.95 g／L，作為供試品溶液，用供試品溶液及BET用水分別稀釋內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5 EU／mL的系列溶液。每個(gè)濃度平行做4管，分別與2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU／mL的鱟試劑反應(yīng)，另取供試品溶液和BET用水做2管陰性對(duì)照（NC），參考文獻(xiàn)[4－6]進(jìn)行干擾試驗(yàn)，按公式 Es＝lg－1（∑ Xs／4）和 Et＝lg－1（∑Xt／4）計(jì)算各系列反應(yīng)終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的絕對(duì)值。結(jié)果見(jiàn)表3（表中 Es及 Et分別為用BET用水、供試品溶液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值）?？梢?jiàn)，Es均在 0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，且 Et均在0.5 Es～2.0 Es范圍內(nèi)，表明鹽酸伊立替康注射液稀釋成0.95 g／L后對(duì)TAL（λ＝0.25 EU／mL）的鱟試劑試驗(yàn)無(wú)明顯干擾作用，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的驗(yàn)證

取3個(gè)批號(hào)的供試品，用堿性調(diào)節(jié)稀釋劑Ⅱ調(diào)節(jié)樣品pH至6.0～7.0，用BET用水稀釋為0.95 g／L，使用λ＝0.125 EU／mL的2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，并按文獻(xiàn)[4－6]報(bào)道的方法做陽(yáng)性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對(duì)照，結(jié)果3批鹽酸伊立替康注射液的內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。詳見(jiàn)表4。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物，O－特異性鏈、核心多糖和類(lèi)脂A是其主要化學(xué)成分，O－特異性鏈決定了菌體熱原的特異性，類(lèi)脂A是引發(fā)發(fā)熱、血流動(dòng)力學(xué)改變等內(nèi)毒素毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)[7－9]。細(xì)菌內(nèi)毒素研究表明，細(xì)菌在正常狀態(tài)時(shí)不釋放細(xì)菌內(nèi)毒素，只有當(dāng)細(xì)菌死亡自溶或黏附在其他細(xì)胞時(shí)才釋放。

表3 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

對(duì)于熱原物質(zhì)的檢查，2015年版《中國(guó)藥典》收載的方法有細(xì)菌內(nèi)毒素法和家兔熱原法，雖然后法自建立后對(duì)有效遏制臨床熱原反應(yīng)事件的發(fā)生發(fā)揮了巨大作用，但同時(shí)也充分暴露了其不足的一面，如試驗(yàn)周期長(zhǎng)、靈敏度低、重復(fù)性差、檢測(cè)成本高等[10]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，包括凝膠法和光度測(cè)定法，后法包括濁度法和顯色基質(zhì)法。與家兔熱原法相比較，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有重復(fù)性好、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確和可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。鹽酸伊立替康注射液在臨床通過(guò)靜脈給藥，直接進(jìn)入患者血液循環(huán)，如果內(nèi)毒素含量超過(guò)一定限量，則可引起熱原反應(yīng)，甚至導(dǎo)致患者死亡。因此，對(duì)其熱原的控制尤其重要。

鹽酸伊立替康注射液的pH為 3.0～4.0，本試驗(yàn)研究了樣品 pH對(duì)凝膠法結(jié)果的影響，當(dāng)干擾試驗(yàn)采用單一稀釋法時(shí)，供試品系列（NPC）反應(yīng)呈陰性，結(jié)果表明經(jīng)稀釋后的樣品對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)有明顯干擾作用。鱟試劑雖有一定的緩沖作用，但與內(nèi)毒素之間是一個(gè)復(fù)雜的酶促反應(yīng)過(guò)程，pH可影響凝膠的形成。為了減少由pH值所產(chǎn)生的干擾作用，本試驗(yàn)中用堿性調(diào)節(jié)稀釋劑Ⅱ調(diào)節(jié)樣品pH至6.0～7.0。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鹽酸伊立替康注射液限值設(shè)定為0.264 EU／mg，樣品用BET用水稀釋至質(zhì)量濃度為0.95 g／L時(shí)，對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)明顯干擾作用。因此，可用凝膠法對(duì)鹽酸伊立替康注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

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Study on the Bacterial Endotoxin Test Method for Irinotecan Hydrochloride Injection

Wang Tingting1，Li Heng1，Zhou Rui2
（1.Lianyungang Institute for Drug Control，Lianyungang，Jiangsu，China 222006； 2.Chia－tai Tianqing Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Lianyungang，Jiangsu，China 222006）

Objective To establish the bacterial endotoxin test method of irinotecan hydrochloride injection.Methods According to the appendix of Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）1143 gel method for he bacterial endotoxin test，maximal non－interference concentrationsof sampleswere determined by pre－interference test and interference test，then the methodology validation wasconducted.Results There was no interference on bacterial endotoxin test when the sample pH was adjusted to 6.0－7.0 with Alkaline regulatorⅡand concentration diluted to 0.95 g／L with BET water.Conclusion The established method is feasible to detect the bacterial endotoxin of irinotecan hydrochloride injection.

irinotecan hydrochloride injection；bacterial endotoxin test；gel－clot；interference test

R927.11；R979.1

A

1006－4931(2016)22－0069－03

王婷婷，女，主管藥師，主要從事藥物分析工作，（電子信箱）124603079＠qq.com。

2016－07－11)