表沒食子兒茶素沒食子酸酯對X線照射大鼠肺損傷病理形態、M M P－1及T IM P－1蛋白表達的影響

王祥財，梁雷鋒，施華球，許明君，王釔力，衷敬華

（1.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000； 2.廣西壯族自治區玉林市第一人民醫院，廣西 玉林 537000）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對X線照射大鼠肺損傷病理形態、M M P－1及T IM P－1蛋白表達的影響

王祥財1，梁雷鋒2，施華球1，許明君1，王釔力1，衷敬華1

（1.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000； 2.廣西壯族自治區玉林市第一人民醫院，廣西 玉林 537000）

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對放射性肺損傷大鼠肺組織病理形態及MMP－1和TIMP－1蛋白表達的影響，評價EGCG對放射性肺損傷的防治作用。方法 將雄性Wistar大鼠108只隨機分為6組，即正常對照組，放射模型組，大、中、小劑量兒茶素組和潑尼松組。除正常對照組外，其余組均給予X線照射，單次30 Gy。每組分別于照后第14天、30天、60天隨機處死大鼠，取左肺組織常規方法制成石蠟切片，蘇木素－伊紅(HE)染色觀察病理形態變化，采集右肺中葉組織，免疫組化法觀察肺組織MMP－1和TIMP－1蛋白的表達。結果 HE染色顯示，大、中劑量兒茶素組肺泡充血、滲出、出血及炎性細胞浸潤程度均輕于放射模型組。免疫組化結果顯示，與正常對照組比較，14～60 d放射模型組肺組織MMP－1和TIMP－1蛋白表達相應增高，MMP－1／TIMP－1比例增大。與放射模型組比較，中、大劑量兒茶素組MMP－1和TIMP－1蛋白表達明顯減少（P＜0.05），MMP－2／TIMP－2始終處于相對平衡狀態，小劑量兒茶素組MMP－1和 TIMP－1蛋白表達增多，與放射模型組比較無明顯差異（P＞0.05）。結論 放射性肺損傷的病理變化與MMP－1和TIMP－1表達的平衡失調有關，EGCG對放射性肺損傷大鼠有保護作用，其機制可能為通過抑制MMP－1和TIMP－1蛋白表達，從而維持MMP－1／TIMP－1比例的平衡。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；放射性肺損傷；蘇木素－伊紅染色；MMP－1蛋白；TIMP－1蛋白

放射性肺損傷是胸部腫瘤行放射治療時容易出現的常見不良反應，因其發生率高，可造成嚴重不良事件，且臨床尚無特效治療手段，故關于放射性肺損傷保護劑的研究成為目前放射治療領域的研究熱點。放射性肺損傷包括初期的炎癥改變及后期纖維化變化。纖維化的病理特點主要是膠原蛋白的增生，目前認為，MMP－1／TIMP－1是調控細胞外基質膠原蛋白增生的主要酶系之一。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶提取的主要成分，研究證實其在抗炎、防輻射等方面具有一定作用，但將EGCG應用在放射性肺損傷方面的研究卻鮮見，具體機制也尚不明確。本研究中應用EGCG對放射性肺損傷大鼠肺組織進行保護，觀察肺病理形態及MMP－1和TIMP－1蛋白的表達，以評價EGCG對放射性肺損傷的防治作用，為進一步探討其可能的作用機制提供試驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與動物

兒茶素（EGCG，批號為Z20130056)購自江西農業大學。雄性Wistar大鼠108只，平均體質量（200±20）g，動物合格證編號為SCXK2013－026，隨機分籠，每籠6只，由動物室統一喂養。

1.2 動物分組

將108只Wistar大鼠隨機均分為6組，即正常對照組、模型組、兒茶素大劑量[200 mg／（kg·d）]組、中劑量[100 mg／（kg·d）]組及小劑量[50 mg／（kg·d）]組和潑尼松[6.72 mg／（kg·d）]組。正常對照組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射；放射性肺損傷模型組大鼠給予X射線照射進行造模；兒茶素大劑量組大鼠給予X射線照射進行造模，1周后予以兒茶素（200 mg／kg）進行灌胃，1次／天；兒茶素中劑量組大鼠給予X射線照射進行造模，1周后予以兒茶素（100 mg／kg）進行灌胃，1次／天；兒茶素小劑量組大鼠給予X射線照射進行造模，1周后予以兒茶素（50 mg／kg）進行灌胃，1次／天；潑尼松組大鼠給予X射線照射進行造模，1周后予以潑尼松（6.72 mg／kg）灌胃，1次／天。

1.3 動物模型制作

除正常對照組外，其余各組均用X射線照射進行放射性肺損傷模型建立。用23EX型直線加速器（美國瓦里安公司）產生的6 MV X射線，等距離照射大鼠全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，照射面積約4.5 cm×4 cm，大鼠全身其余部分用10 cm后擋鉛屏蔽。源皮距為100 cm，劑量率為240 cGy／min，照射劑量為30 Gy[2]。照后1周，各治療組開始灌胃給藥，正常對照組及模型組灌胃給予等體積的蒸餾水。

1.4 標本獲取和處理

大鼠處死時采用乙醚麻醉，迅速切取肺臟標本置冰鹽水中充分洗滌。

1.5 觀察項目

病理觀察（HE染色）：在 X線照射后不同時間點（分別在第14天、30天、60天），在各組隨機抽取6只大鼠，用2%戊巴比妥鈉30 mg／kg腹腔內注射，麻醉后開胸暴露肺，取肺組織置10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，用常規方法制成石蠟切片，經蘇木素－伊紅（HE）染色。

圖像分析：應用圖像分析儀測組織切片中肺泡壁厚度、肺間質、彈力纖維、肺內成纖維細胞膠原含量。

免疫組化：分別在第14天、30天、60天，在各組隨機抽取 6只大鼠，取大鼠右肺中葉，10%福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續切片，免疫組化采用S－P檢測肺組織MMP－1及TIMP－1蛋白表達。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(s)表示，采用析因分析，多重比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學觀察（HE染色）

各組大鼠肺組織石蠟切片，分別行HE染色觀察動物肺組織一般病理學改變。正常對照組：肺內結構正常。放射模型組：第14，30，60天，肺泡內炎性細胞由少逐漸增多，再逐漸減少，纖維細胞逐漸增多，膠原纖維沉積而表現肺纖維化，大、中劑量兒茶素組肺泡充血、滲出、出血及炎性細胞浸潤等方面程度較輕，炎性細胞、纖維細胞數目明顯少于放射模型組。潑尼松組炎性細胞、纖維細胞數目少于放射模型組，中、大劑量兒茶素組與潑尼松組比較，炎性程度明顯較輕。見圖1。

圖1 照射60 d各組大鼠肺組織HE染色結果（×400）

表1 不同時點各組大鼠肺組織MMP－1表達量比較（s，n＝18）

表1 不同時點各組大鼠肺組織MMP－1表達量比較（s，n＝18）

注：與放射模型組比較， P＜0.05， P＜0.01。表2同。

組別正常對照組放射模型組潑尼松組中、高劑量兒茶素組小劑量兒茶素組平均表達量6.32±2.25 96.08±4.15 49.44±5.30 35.59±4.84 64.55±6.13 14 d 4.35±4.01 57.12±4.54 40.64±5.17 25.54±5.35 46.59±5.15 30 d 3.45±4.02 76.73±6.22 45.62±5.12 28.67±0.11 57.64±5.18 60 d 4.27±4.28 83.58±3.19 58.58±4.18 34.47±5.10 66.79±5.11

表2 不同時點各組大鼠肺組織TIMP－1表達量比較（s，n＝18）

表2 不同時點各組大鼠肺組織TIMP－1表達量比較（s，n＝18）

組別正常對照組放射模型組潑尼松組中、高劑量兒茶素組小劑量兒茶素組14 d 5.35±4.01 42.14±2.24 24.44±4.47 21.43±3.45 34.59±5.15 30 d 5.43±4.42 42.22±4.22 25.52±5.55 22.47±4.11 38.64±5.18 60 d 5.27±4.48 53.35±5.133 29.54±4.58 24.42±4.10 42.79±4.11平均表達量5.32±5.23 56.58±5.12 27.88±4.30 24.54±2.44 42.45±5.43

2.2 大鼠肺組織MMP－1蛋白表達

第14天、30天、60天，放射模型組與正常對照組比較，大鼠肺組織中MMP－1均大量表達（P＜0.01）。中、大劑量兒茶素組大鼠肺組織中MMP－1表達均低于放射模型組（P＜0.01）；小劑量兒茶素組與放射模型組MMP－1表達差異不明顯（P＞0.05）；潑尼松組也均低于放射模型組（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 大鼠肺組織TIMP－1蛋白表達

第14天、30天、60天，放射模型組與正常對照組比較，大鼠肺組織中TIMP－1均大量表達（P＜0.01）；中、大劑量兒茶素組大鼠肺組織中TIMP－1表達均低于放射模型組（P＜0.01）；小劑量兒茶素組與放射模型組比較，TIMP－1表達差異不明顯（P＞0.05），潑尼松組也低于放射模型組（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤經放射治療后引起的炎性反應，臨床無特效藥，常予激素對癥處理，但不良反應大，故探索無毒、高效的放射性保護劑成為了臨床研究的熱點。

放射性肺損傷包括初期的炎癥改變及后期纖維化變化。纖維化病理特點主要是膠原蛋白的增生，目前認為，MMP－1／TIMP－1是調控細胞外基質膠原蛋白增生的主要酶系之一。當發生放射性肺損傷時，肺膠原蛋白不斷增加，從而刺激MMP－1的產生，以期降解膠原蛋白，但隨著MMP－1產生的增加，也會引起TIMP－1的升高，以達到MMP－1／TIMP－1平衡。隨著放射性損傷程度的加大，MMP－1不斷產生，抑制MMP－1的TIMP－1不能隨之繼續產生，從而導致 MMP－1／TIMP－1失衡，最終導致纖維化。國內學者研究發現，MMP－1是放射性肺損傷中炎癥和纖維化過程中的高風險因素[3]。Costa等[4]研究認為，MMP－1參與了放射性肺損傷中膠原蛋白的降解，在放射性肺纖維化中起著重要的調節作用。

本研究中發現，大、中劑量兒茶素組肺泡充血、滲出、出血程度均顯著輕于放射模型組，炎性細胞和纖維細胞數目均明顯少于放射模型組；與正常對照組比較，14 d至60 d放射模型組肺組織MMP－1和TIMPs蛋白表達相應增高，MMP－1／TIMP－1比例增大，MMP－1大量增多，反而抑制了正常膠原降解的正反饋，從而使膠原基質沉積增多，最終導致肺纖維化[5－7]。與放射模型組比較，中、大劑量兒茶素組MMP－1和TIMP－1蛋白表達明顯減少（P＜0.01或 P＜0.05），MMP－1／TIMP－1始終處于相對平衡狀態，從而利于膠原降解正反饋[8]。小劑量兒茶素組MMP－1和TIMP－1蛋白表達增多，與放射模型組比較差異不明顯。說明中、大劑量兒茶素組對放射性肺損傷大鼠有一定的保護功能，其機制可能與其能調節大鼠肺組織MMP－1／TIMP－1比例始終維持平衡有關[9－12]。說明放射性肺損傷的纖維化過程是受復雜的網絡調控機制決定，本研究結果提示，MMP－1／TIMP－1比例平衡是調節肺纖維化的重要因素之一。

我國是天然藥物大國，茶葉在我國分布廣泛，茶兒茶素作為茶葉的提取物，制作工藝成熟，價格低廉。故深入研究茶兒茶素等中藥關于放射性肺損傷防護作用的基礎理論，對于促進中醫現代化具有重要意義，也為開發防護放射性損傷的中藥制劑提供了新的思路[13－15]。

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Effects of EGCG on the Pathological Morphology and Expression of MMP－1，TIMP－1 Protein in Radiation－Induced Lung Injury of Rats

Wang Xiangcai1，Liang Leifeng2，Shi Huaqiu1，Xu Mingjun1，Wang Yili1，Zhong Jinghua1
（1.The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，GanZhou，Jiangxi，China 341000； 2.Yulin First People′s Hospital，Yulin，Guangxi，China 537000）

Objective Toobservetheeffect of epigallocatechin gallate（EGCG） on thepathologicalmorphology and expression of MMP－1，TIMP－1 protein in radiation－induced lung injury of rats，and to evaluate the effect of EGCG on prevention of radiation－induced lung injury.Methods 108 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups：normal group，radiation model group，large，medium and small dose of EGCG group，prednisone group.Except for the normal group，the remaining groups were given X ray of 30 Gy dose.Rats were sacrificed randomly on 14，30 and 60 d after radiation；routine method of left lung tissue was made into paraffin sections；HE staining was used to observe the pathological morphological changes.The left lung tissue was made into paraffin sections by routine method；theexpression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissuewasobserved by immunohistochemicalmethod.Results HE staining showed that the degree of alveolus congestion，exudation，hemorrhage and infiltration of inflammatory cells in the large and medium dose EGCG group were lighter than that in the radiation model group.Compared with the normal control group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissue in the radiation model group was elevated and the ratio of MMP－1／TIMP－1 was increased on 14－60 d.Compared with the radiation model group，the MMP－1 and TIMP－1 protein expressions in the large and medium dose EGCG group were significantly decreased（P＜0.05），and the MMP－2／TIMP－2 remained in relative equilibrium state；in small dose EGCG group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein increased，and there was no significant difference compared with the radiation model group（P＞0.05）.Conclusion The pathologic changes of radiation－induced lung injury are related to the imbalance of MMP－1 and TIMP－1 expression.EGCG has a protective effect on radiation－induced lung injury in rats，and its mechanism may be through inhibiting the expression of TIMP－1，MMP－1，in order to maintain the balance of MMP－1／TIMP－1 ratio.

epigallocatechin gallate；radioactive lung injury；HE staining；MMP－1 protein；TIMP－1 protein

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0026－04

王祥財（1968－），男，主任醫師，副教授，碩士研究生導師，主要從事臨床淋巴瘤、肺癌、肝癌、胃腸道惡性腫瘤的化學治療及介入治療，（電話）0797－8265619；衷敬華，博士研究生，主治醫師，本文通訊作者，（電子信箱）zaijunhao2009＠126.com。

2016－08－18)

江西省衛生廳中藥局基金項目，項目編號：2013A078；江西省教育廳青年科學基金項目，項目編號：GJJ12561。