環境對水稻花時的影響和花時調查統計方法的改進

張萌張華麗戴冬青 李西明 馬良勇

（中國水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通訊作者：ricemaly@163.com）

環境對水稻花時的影響和花時調查統計方法的改進

張萌#張華麗#戴冬青 李西明 馬良勇*

（中國水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通訊作者：ricemaly@163.com）

花時在雜交稻制種中有著關鍵作用。明確環境對水稻花時的影響，選擇合適的花時調查統計方法可以加快對花時性狀的研究。本文以早花時突變體eft、正常花時材料日本晴（NIP）以及構建的eft/NIP重組自交系群體為材料，通過分期播種親本，明確了溫度和光照對花時的影響規律；提出了一種以親本為標準的改進的水稻花時調查和統計方法。基于該改進的花時調查和統計方法，能有效減弱環境因素對花時性狀的影響，可將樣本間的花時誤差由原來的0～30 min縮減至0～5 min，為水稻花時性狀的遺傳研究提供較為精確的數據。

水稻；花時；溫度；日長；調查統計方法

水稻（oryza sativa L.）是典型的自花授粉作物，水稻的穩定高產在保障糧食安全中有著至關重要的作用。然而在水稻的生長周期中，病害、蟲害、干旱及高溫等都會造成其最終產量的顯著下降[1]。在水稻開花期，超過32℃的高溫會引起小穗不育從而造成大量減產[2-3]。由于全球氣候變暖，由高溫脅迫造成的水稻減產正逐步成為糧食安全的威脅，而水稻早花時可以有效避免高溫等不良天氣對受精的影響，從而大大提高結實率[3-4]。隨著雜交水稻的廣泛應用，雜交水稻種子生產過程中父母本的花時不遇（即父母本開花高峰錯位的現象）導致制種失敗或制種產量低的問題日益突出[5-6]。特別是近年來隨著秈粳亞種間雜種優勢利用研究的不斷深入，一批強優勢的“粳不秈恢”（不育系偏粳，恢復系偏秈）組合如“甬優”、“春優”和“浙優”系列的育成，為大面積水稻高產帶來了新的機遇。但“粳不秈恢”制種產量普遍低下，嚴重制約了這些強優勢組合在生產上的廣泛應用[7]。究其原因，主要是因為粳稻不育系往往柱頭不外露或外露率較低，只能在不育系開花時接受同時開花的恢復系的花粉[8-12]。然而，由于不育系本身的生理特性，開花時間比正常的品種晚，而秈稻又比粳稻開花早約1 h，造成“粳不秈恢”制種父母本嚴重花時不遇，從而制種產量低[6，13-15]。因此，遺傳育種家越來越重視水稻花時的研究。

但是，由于水稻花時的差異，不僅與遺傳因素有關，而且還受到環境和人為因素的影響[16]，花時的調查困難成為制約花時研究的關鍵。影響花時的環境因素主要包括溫度、濕度、光照、風力及CO2等。其中，環境因素中對父母本花時影響最大的是溫度。前人的田間觀察研究結果表明，一天的平均氣溫影響開花的早晚，高溫利于開花提早[2，17-19]。因此，本文通過分期播種的方法明確溫度對花時的影響規律，并基于這一規律改進了花時調查統計方法，以期為水稻花時的遺傳研究提供精確可靠的數據，為今后水稻及其他植物的花時研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

早花時突變體eft：從春江06（CJ06）和TN1所構建的DH群體中發現的早花時突變體（eft），在海南3月中旬抽穗，開花時間為上午9∶00～9∶30，比正常秈稻早2 h左右；在杭州8月上中旬抽穗，開花時間為上午7∶00～7∶30，比正常秈稻開花早約1.5～2 h；9月上中旬則在9∶00左右開花，比正常秈稻早約2 h。

正常花時親本日本晴（Nipponbare，NIP）：典型粳稻，相同環境下比eft的花時遲1.7～3.5 h，平均約推遲

2.5 h。

重組自交系群體（F10）：2008年夏利用早花時突變體eft和典型粳稻品種日本晴雜交，獲得F1雜交種子并于當年冬季種植于海南陵水南繁基地；收獲F2種子，并于2009年夏種植于中國水稻研究所富陽試驗基地；其后通過單粒傳的方法，在杭州和海南加代，至2015年獲得農藝性狀穩定的F10群體，包含184個株系。

表1 親本eft和NIP的花時記載情況

所有材料均種植于中國水稻研究所富陽試驗基地，每株系2行，每行6株，單本種植，常規栽培管理。

1.2 試驗方法

水稻開花在一瞬間完成，精確的記錄每個開花瞬間相對困難。花時的研究一般以群體的盛花時研究為主，調查多采用目測法，即以小區為單位觀察記錄水稻開花高峰。花時的調查和數據的統計對花時性狀研究的精確性和可靠度有著至關重要的作用。

1.2.1 環境影響花時規律的研究

杭州屬長日照，該重組自交系在此長日照下抽穗期較為分散，持續時間較長，如重組自交系群體中最早的株系抽穗期為7月27日，最遲的株系9月23日才抽穗。此段時間內，包括氣溫、濕度、光照等的外界環境不斷變化，水稻花時也隨之變化。為排除此時段內外界環境對花時的影響，必須清楚環境如何影響花時。親本采用分期播種，自4月29日起，每隔6 d播種1期，共播種7期。日本晴的生育期較短，開花時間從7月25日的9∶05到8月28日的10∶30；eft的花時記載則從7月28日的7∶20到9月25日的9∶40，持續到整個RIL群體抽穗期。除雨天外連續記錄2個親本的具體花時，每5 d取1個平均值作為該段時間的花時，并對eft的花時與溫度和日照長短分別進行相關性分析。

水稻開花期溫度等環境數據的獲得：通過網站http∶//richurimo.51240.com獲取試驗地點的日平均溫度、最高溫度、最低溫度和晝長（日照長短）數據。

1.2.2 花時性狀的調查

2015年夏，調查杭州F10花時性狀，采用單株目測動態調查的方法。根據真實花時不斷變換調查時間，使記載數據與真實花時相近，減少人為因素的干擾。例如，上午9∶00調查時發現株系1已達盛花，不能確定該株系早在9∶00之前多久盛花，第2天提早5 min左右調查，若株系1未開或未達盛花，則將該株系花時記為9∶00；反之，第3天繼續提早5 min于8∶50左右調查，若株系1未開或未達盛花，則將該株系花時記為8∶ 55；反之，繼續提前5 min調查，直至發現該株系未達盛花為止。此方法必須保證調查這幾天天氣變化不大，若中間天氣不符，可選擇剔除不一致天氣的記載數據，以避免環境變化對調查產生的誤導。每個株系均連續調查5～7 d，以期得到更接近真實花時的數據。本研究中水稻盛花時標準定為每株系（2行12株）每叢有3朵以上穎花開放。

1.2.3 花時數據的統計

本研究中花時目測法調查的花時性狀數據基本接近真實花時，但是整個重組自交系（RIL）群體抽穗期歷時較長，使每個株系開花時間的差異不僅取決于遺傳因素，同時受氣候環境變化的影響，沒有一個統一的標準，無法將所記載花時數據作為QTL定位數據，故在改進調查方法的基礎上改進花時統計方法。將分期播種的親本花時作為同一生育期RIL群體各株系的統計標準，以減少環境的干擾。

本試驗新創建了不同于前人分級統計法[20-21]的花時差統計法，即調查重組自交系花時期間，每天采用目測法調查早花時親本eft花時和重組自交系花時，將同一個生育期的早花時親本eft作為參考，計算其與同一天開花的株系的花時之差（花時差=某株系的盛花時-同期抽穗的親本eft的盛花時）作為統計數據，以分鐘（min）為單位，為后續遺傳分析所用。

2 結果與分析

2.1 溫度對花時的影響

從表1可看出，不同時期內，親本eft和NIP各自的花時相差很大，但是親本eft的花時均早于同一時期的NIP的花時，二者的花時相差約為1.7～3.5 h。

利用eft的花時以及水稻開花期試驗地的氣溫及日照長短，構建了親本eft具體花時隨環境因素的變化散點圖（圖1）。從圖1整個RIL抽穗期間親本eft花時與溫度、光照等環境因素的變化趨勢，可以看出在整個重組自交系抽穗期間，日平均氣溫逐漸降低，eft花時隨之逐漸推遲，晝長則呈現一定斜率下降的趨勢，即總體來說，隨著時間的推移，溫度逐漸降低，日照時數減少，花時推遲。親本eft花時與溫度、日照長短的相關性分析表明，eft花時與日最低溫、日平均氣溫、日最高溫、日照長短的相關系數分別為-0.9019**、-0.8429**、-0.7756**、-0.9152**（表2）。表明花時與溫度、日照長短均呈極顯著負相關，其中日最低溫度決定了水稻的初始開花時間，這與一天中氣溫變化的規律相符。這一結果進一步從數據上直觀證明“溫度升高，花時提早；日照時數增加，花時提早”的結論[2，17，22]，并且進一步表明最低溫度直接影響花時遲早。

表2 親本eft與溫度、日照長度的相關性分析

圖1 RIL抽穗期內親本花時、氣溫、日照時數的變化

圖2 RIL群體花時調查及統計分布結果

2.2 花時調查統計結果

花時調查結束后，將所記載的RIL花時數據，按照每30 min歸為一級，分級統計可將184個RIL群體分為9級，其中早花時親本eft屬于第1級，正常花時親本NIP屬于第6級，兩者花時差別較大（圖2A）。以各株系與eft的花時差作為統計數據的結果見圖2B。與分級法類似，花時差法也在中部出現一個波谷，即處于eft花時與NIP花時之間有個時間段，達盛花時的株系數明顯較少（圖2B）。

2.3 與前人調查統計方法的比較

前人花時的研究多采用分級目測法[20-21]。萬國等[21]將花時調查周期控制在30 min，并將花時分為6級，9∶30以前定為第1級，9∶31～10∶00為第2級，10∶01～10∶30為第3級，以此類推。而本試驗將花時性狀的調查統計方法分割成兩個獨立的部分，即目測調查和花時差統計，調查時盡量使記載數據接近真實花時，統計時又盡可能減少環境的影響。2種調查統計方法并沒有實質性差別，最大的不同在于精確度。前人所采用的花時分級研究方法相對較為粗糙，不僅沒有考慮到環境對花時的影響，而且花時的絕對誤差在0～30 min之間，與真實花時的差距有大有小，兩個相鄰花時級數的株系真實花時差在1～59 min，同一級數的株系真實花時差也在0～30 min，很難達到一個統一的標準；而本研究改進的花時目測法根據真實花時隨時更改調查時間，多次追蹤調查，使調查結果更為精確，絕對誤差僅在幾分鐘之內，更加接近真實花時，改進的花時統計法只需計算早花時親本eft與每個株系的花時差，此數據直接作為統計數據用于后續分析，這一方法使花時數據保持原貌，使表型數據值更加豐富，可能會使花時QTL定位更為精確。

3 討論

本研究表明，雖然整個重組自交系抽穗期內，所調查的親本花時除了部分數據來自日本晴外，整個生育期完整的花時數據則來自同一材料eft，但花時差異卻十分明顯，這只能是環境因素所導致的。蒯建敏等[17]研究也表明，氣象條件的不一致性是造成同一品種在不同日期間花時差異的重要乃至主要因素。圖1表明，溫度升高促進花時提早，溫度降低則使花時推遲，這與前人的研究一致[8-9，17]；此外，日照時數的減少使花時推遲，這也與蒯建敏等[17]研究結果一致，即日照時數的增加對水稻有促進開花的作用。有趣的是，在9月1日至5日這段時間內，溫度上升，花時反而推遲，與正常趨勢相悖（圖1）。推測有2種可能性：一是存在一個晝長臨界點，即在晝長＜13 h時，花時不再隨溫度的升高而提早，這段時間內花時主要受日照長短的影響，而受溫度影響不大；二是花時受溫度和日照長短的影響，兩種因素相互協調又相互競爭，正常情況下，二者共同調控花時早遲，但當二者發生沖突時，強的一方起主導作用，此時花時主要受強環境因子影響。高溫促進花時提早是否存在一個日照時數臨界點，還有待于進一步研究。

無論溫度和日照如何影響，本研究中兩親本的開花時間差基本固定，啟示筆者可以用品種間的時間差來作為區分不同品種水稻的依據，即用目標單株（株系）與同一親本的花時差來作為該單株（株系）的花時統計數據。

目前用于花時的研究方法主要是點花法[20，23-25]和目測法[17，19，21]。點花法是以穗為單位的調查方法，標記單穗在一定時間間隔內的開花數，一般情況下全部或部分剪除已開穎花，以方便統計下一時段的開花數；目測法則是以小區為單位的調查方法只是觀察記錄水稻開花的高峰期。二者雖在廣泛應用，但是由于人為干擾和溫度、日照等環境因素的影響很難得到大量的精確數據，目前花時性狀的調查仍是制約花時遺傳研究和解決花時不遇問題的主要因素。

本文所提出的經過改進的花時研究方法是在傳統的目測法的基礎上發展起來的，秉承了目測法高效、快速的優點，同時又極大的避免了傳統目測法記載誤差過大的缺陷。本方法操作簡單、快捷、可靠，與前人方法相比，該方法得到的數據，完全可以滿足QTL定位的要求。因此，該改進方法在植物花時研究中將有廣泛的應用前景。

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Environment Influence and Improvement of Investigation and Statistical Methods on Flowering Time in Rice

ZHANG Meng#,ZHANG Huali#,DAI Dongqing,LI Ximing,MA Liangyong*
（China National Rice Research Institute,Hangzhou,310006,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author:ricemaly@163.com）

Rice flowering time is a critical factor for seed production in hybrid rice.The research of rice flowering time could be promoted by clarification the influence of environment and utilization appropriate investigation and statistical method.In the present study,the regularity of flowering time changing with temperature and day length was clarified though sowing parents by stages.Simultaneously,an effective investigation and statistical method was firstly established to investigate rice flowering time in the field no matter how the environment changes,based on a recombinant inbred line population including 184 lines from the cross between Nipponbare and the early flowering time mutant eft.The improved method could effectively mitigate the influence of environmental on flowering time and reduce the error of flowering time from 0～30 min to 0～5 min.The method may provide more accurate data to study rice flowering time traits in the future.

rice;flowering time;temperature;day length;investigation and statistical methods

S511

A

1006-8082（2016）06-0010-05

2016－09－08

國家“863”計劃（2014AA10A604-15）；國家自然科學基金（31071080）；浙江省公益性農業項目（2011C22002）；國家自然科學基金（31501288）；浙江省自然科學基金（LQ16C130002）；中央級科研院所基本科研業務費專項（2014RG003-3）