利用多重數字PCR檢測KRAS相關突變

鄔升超 黃 斐 趙 瀛 虞 倩 韓 序 王蓓麗 張春燕 郭 瑋 樓文暉 潘柏申△

(1復旦大學附屬中山醫院檢驗科,2普外科 上海 200032)

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利用多重數字PCR檢測KRAS相關突變

鄔升超1黃 斐1趙 瀛1虞 倩1韓 序2王蓓麗1張春燕1郭 瑋1樓文暉2潘柏申1△

(1復旦大學附屬中山醫院檢驗科,2普外科 上海 200032)

目的 建立多重數字PCR體系檢測血漿細胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)中KRAS第2外顯子12、13密碼子的7種突變。方法 構建7種KRAS突變型質粒用以建立多重數字PCR檢測體系,以靈敏度、特異度和動態范圍為主要參數評估體系的性能。利用該體系檢測15例手術可切除的胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者血漿cfDNA中KRAS第2外顯子12、13密碼子突變情況,并與ARMs的檢測結果進行比對。結果 自建的多重數字PCR在0.01%～10%的動態范圍內線性良好。兩個檢測體系的靈敏度分別可達到0.025%和0.043%。15名PDAC患者組織中KRAS突變的陽性率達到100%。數字PCR檢測血漿cfDNA所得的結果與組織結果的匹配率達到40%,ARMs檢測組織和血漿cfDNA結果的匹配率為20%。15例樣本中使用多重數字PCR檢測到血漿cfDNA的最低豐度達到0.09%。結論 多重數字PCR具備高靈敏度和特異性,可用于準確定量外周血cfDNA中KRAS相關突變的水平。

多重數字PCR; 血漿游離DNA; KRAS

RAS基因突變被認為與人類腫瘤發生密切相關。RAS家族中的KRAS基因12、13密碼子的突變在結直腸癌和胰腺癌中均有較高的發現率,被認為與腫瘤的發生、復發及患者預后直接相關[1-2]。胰腺癌尤其是胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者中約有75%～95%攜帶KRAS突變基因,其與CDKN2A、SMAD4和TP53在基因水平的改變被認為與胰腺癌的發生和發展直接相關[3-4],監測KRAS在體內突變情況的變化有助于理解基因改變與病情發展之間的聯系。

外周血細胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)是來自正常細胞和腫瘤細胞死亡后釋放的核酸片段的總稱。由于其在體內的半衰期較短且細胞釋放的核酸會進入外周血,因此cfDNA較之于組織標本更能實時全面地反映患者體內的腫瘤情況[5-6]。另一方面,患者對非侵入性樣本采集方式的接受度更高,cfDNA具有良好的臨床應用前景。但是如何準確定量cfDNA一直是個難題:高度片段化、極低的目的片段濃度及復雜的背景噪音干擾,使得傳統基于實時熒光定量PCR建立的方法在靈敏度、特異性及重復性上均無法滿足要求[7-8]。

液滴式數字PCR作為新一代數字PCR檢測系統,得益于無限稀釋的概念,具備絕對定量、高靈敏度、高特異性、重復性好以及抗干擾能力強等優點[9]。在腫瘤相關領域,數字PCR已經被用于肺癌患者的液態活檢,以輔助指導靶向藥物的使用[10];亦可用于結直腸癌患者,高靈敏度的檢測系統能夠從外周血中發現耐藥突變,且外周血與組織的一致性高[11-12]。較之肺癌和結直腸癌,數字PCR在其他癌癥尤其是胰腺癌中的相關報道較少。本文旨在自建多重數字PCR體系檢測KRAS基因12、13密碼子的7個突變,并對該系統進行初步的性能驗證。通過對15例PDAC患者的標本進行檢測,初步評價該系統的檢測能力。

材 料 和 方 法

患者基本信息 選取來自復旦大學附屬中山醫院普外科病房的15名PDAC患者以及8名來自體檢中心的健康人,其中健康人經過影像學確認不存在累及器官的病變,且血清結果顯示無異常。15名PDAC患者經影像學發現胰腺占位,考慮為胰腺癌,行胰腺部分或全部切除術,術前獲取6 mL全血樣本,術中獲取組織用以制備4%甲醛溶液固定石蠟包埋切片。所有23名受試者均簽署知情通知書。

組織DNA與血漿DNA抽提 從我院病理科獲得符合要求的4%甲醛溶液固定的石蠟包埋樣本(formalin-fixed and parrffin-embedded,FFPE),每例患者6張,使用QIAamp DNA Mini Kit(德國Qiagen公司)抽提組織DNA,-20 ℃保存備用。術前分別抽取10 mL外周血全血(EDTA抗凝管)和6 mL血清,1 900×g離心后用于CA199和CEA水平的測定。吸取離心后的血漿,16 000×g再次離心,吸取上清,-80 ℃凍存備用。抽提前再次以16 000×g離心,取上清液,使用QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit(德國Qiagen公司)抽提cfDNA。使用Nanodrop (美國Thermo Fisher公司)初步定量抽提后的cfDNA濃度,-20 ℃保存。

質粒構建 質粒用于雙重和多重數字PCR體系的建立和性能驗證。以包含KRAS野生型片段的重組質粒(貨號:RC201958,美國Origene公司)為模板定點誘導常見的7種KRAS突變型(G12D、G12V、G12s、G12V、G12A、G12R和G13D)。為確保數字PCR生成的液滴狀態穩定,構建好的質粒需使用對應的限制性內切酶切割,使最終用于擴增的包含目的片段的模板長度小于3 000 bp,同時保證質粒處于線性狀態。酶切后,使用天根DNA純化試劑盒(目錄號:DP214)純化質粒,-20 ℃保存備用。為避免質粒污染操作環境及質粒間的交叉污染,實驗操作過程中保證僅有一個樣本管處于打開的狀態,同時實驗結束后打開紫外燈照射操作室。

探針和引物的設計 本實驗使用RainDrop數字PCR系統,分為收集裝置(Source)和讀取裝置(Sense),分別用于完成液滴的形成和信號采集與分析兩個步驟。按照儀器要求,需使用VIC和FAM兩種熒光對Taqman探針5’端進行標記,使用MGB淬滅基團對Taqman探針3’端進行標記。為滿足多重數字PCR設計時的需要,某種特定的突變形式需要用兩條不同熒光標記的Taqman探針,且通過調整探針濃度使得不同突變類型的液滴得以在二維平面中區分[13],具體序列如表1、2所示。

表1 多重數字PCR多重體系1的探針序列和濃度

表2 多重數字PCR多重體系2的探針序列和濃度

多重數字PCR體系構建 多重數字PCR的體系中包含野生型和多種突變型探針。將G12D、G12R、G12V及野生型構成四重數字PCR,命名為體系1(multiplex-1);將G13D、G12A、G12C、G12S以及野生型構成五重數字PCR,命名為體系2(multiplex-2)。體系1和2的體積均為40 μL,包括20 μL Genotyping Master Mix(美國Life Technologies公司)、0.5 μmol/L正向引物(5’-CTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGG-3’)和反向引物(5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCAC-TC-3’)、野生型探針和不同類型的突變型探針(表1)、1.6 μL液滴穩定劑(美國RainDance Technologies公司)和不低于50 ng的模板量,剩余用ddH2O補足。整個體系配制完成后,將混合液混勻,瞬時離心,轉移至芯片上對應的加樣孔中,使用Source將40 μL混合液體制備成10-12級別的均勻液滴。處理完畢的樣本使用ABI Veriti96 PCR進行擴增(美國Applied Bio-systems公司),循環條件如下:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s、64 ℃退火15 s、60 ℃延伸45 s,共45個循環,98 ℃再延伸10 min后,12 ℃恒溫備用。最后將擴增好的液滴轉移至Sense中進行讀取。

數字PCR數據分析 數據分析使用Raindrop Analyst 10.0.7r2(美國RainDance Technologies公司)完成,具體步驟:(1) 雜音的排除。雜音的存在會嚴重干擾最后計數的結果,導致假陽性的發生。利用軟件中自帶的功能“EVENT&對應通道”來判斷該坐標軸中散點的性質:如果散點聚成一團出現,則提示為雜音;如果為均勻分布,則提示為陽性液滴,計數有效。(2) 熒光補償。每個液滴均不可避免存在熒光交叉的情況,具體表現為VIC通道中可以檢測到部分FAM熒光信號,反之也是如此。熒光補償僅能改變“簇”的位置,不改變“簇”的相對位置和其中所含散點的數量。(3) 設門和定值。在多重體系中加入對應質粒獲得的散點分布圖可用于設定“門”,“門”是一個標準化的概念,其大小和位置是固定的,“門”所包含的散點的集合即為“簇”,散點的個數對應為液滴數,減去空白檢測限(limit of blank,LOB)即為目的片段的拷貝數。(4) 結果解讀。結合操作者對整個圖形的定性分析(噪音點的分布情況,不同突變型之間的距離、總共形成液滴的個數),將結果分為“陰性”、“陽性”和“不置可否”3種情況。對于無法確認的樣本使用自建的雙重數字PCR進行檢測,或增加一倍的模板量后再使用多重數字PCR進行測試,以此為最終可信的結果。

多重數字PCRLOB建立與驗證 使用質粒作為樣本建立初始LOB-A。利用體系1和2分別對4例KRAS野生型質粒標本(每個體系加入8 μL樣本)進行LOB測試,所得結果取均值,根據泊松分布公式計算得到每個基因型對應的LOB-A。再以健康人的混合血漿cfDNA為標本,對LOB-A結果進行驗證。同樣在每個體系中加入8 μL混合cfDNA,重復8次,計算均值并根據泊松分布公式得到結果LOB-B,將其與LOB-A進行比較。

多重數字PCR動態檢測范圍測試 使用雙重數字PCR定量檢測KRAS突變型和野生型的拷貝數,將突變型和野生型質粒(copies/μL)分別按照0.01%、0.1%、1%和10%進行稀釋,獲得4個濃度梯度的混合樣本,供線性驗證使用。使用多重數字PCR檢測上述樣本,以理論拷貝數和實際拷貝數之間的偏移結合復相關系數R2評價多重數字PCR的線性性能。

多重數字PCR的靈敏度測試 兩個多重數字PCR體系中分別加入KRAS野生型質粒(約50 000 copy/μL)和任一種突變型質粒(約20 copy/μL),充分混勻后(使用雙重數字PCR確認濃度范圍)測定混合樣本中突變型和野生型的拷貝數,并以“突變型/(突變型+野生型)”的比值MUT/(WT+MUT) %來描述多重數字PCR的靈敏度。

ARMs方法檢測組織和外周血KRAS突變 選用商品化試劑盒AmoyDx?KRAS突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)檢測抽提后的組織DNA和血漿cfDNA中KRAS基因的突變情況。

結 果

入組患者的基本信息 15例PDAC患者中男性11例,女性4例,平均年齡為(56.21±4.52)歲。根據腫瘤位置不同進行分類:7例在胰頭,3例在胰頸,5名在胰尾。根據TNM分期進行分類:7例為ⅠA,8例為ⅡB。血清CA-199的中位水平為141.4 U/mL(0.7～2 010.0 U/mL),血清CEA的中位水平為4.8 U/mL(1.5～54.7 U/mL)。

多重數字PCR體系的建立 通過調整探針的濃度和類型,獲得多重數字PCR的兩個檢測體系(圖1)。在Multiplex-1體系中,FAM標記的包含G12D和G12V突變型的液滴分布在靠近橫坐標軸的位置,且G12D的熒光強度高于G12V;VIC標記的包含野生型的液滴則分布在靠近縱坐標軸的位置;FAM和VIC標記的包含G12R突變型的液滴位于坐標平面45°角的位置。在體系2中,FAM標記的包含G12C和G12S突變型的液滴位于靠近橫坐標軸的位置,且G12S的熒光強度高于G12C;VIC標記的包含野生型和G13D突變型的液滴位于靠近縱坐標軸的位置,FAM和VIC標記的包含G12A突變型的液滴位于坐標平面45°角的位置。所有不包含目的擴增模板的液滴未能進行有效擴增,均位于坐標平面的左下側。

多重數字PCR LOB的建立 實驗組中兩個體系分別檢測4例野生型質粒標本,拷貝數的取值范圍為11 000～14 000 copy/μL,結果取均值,根據泊松分布公式計算得到每個基因型的LOB-A分別為:G12D(9)、G12R(5)、G12V(4)、G13D(8)、G12A(5)、G12C(4)和G12S(7)。在驗證組中,兩個體系分別檢測來自于健康人的混合血漿cfDNA(拷貝數約為180 copy/μL),所得的LOB-B結果分別為:G12D(7)、G12R(4)、G12V(3)、G13D(7)、G12A(5)、G12C(3)和G12S(6)。每個體系使用不同數量級的樣本測定LOB,最終得到的結果近似(圖2)。

多重數字PCR線性驗證 檢測MUT/(WT+MUT)%為0.01%、0.1%、1%和10%的樣本(圖2)。將4個濃度的結果擬合直線,所得的復相關系數R2結果如下:G12V(0.91)、G12D(0.99)、G12R(0.91)、G12A(0.9)、G12S(0.99)、G12C(0.94)、G13D(0.99),提示該多重數字PCR檢測系統具有良好的動態檢測范圍。

多重數字PCR的靈敏度測試 通過對自制的混合樣本進行檢測,在體系1的47 672個KRAS野生型拷貝中發現21個G12D拷貝,在體系2的48 972個KRAS野生型拷貝中發現25個G12C拷貝,分別減去LOB后實際混合樣本中突變型的豐度分別為0.025%和0.043%,即在體系1中每3 972個野生型拷貝中可以檢測到1個G12D突變型拷貝,在體系2中每2 332個野生型拷貝中可以檢測到1個G12C突變型拷貝(圖3)。

LOB-A:LOB calculated according to plasmid; LOB-B:LOB calculated according to cfDNA from pooled plasma cfDNA.

圖2 多重數字PCR體系LOB的建立

Fig 2 LOB of multiplex digital PCR

PDAC患者組織和血漿樣本的KRAS突變情況使用ARMs方法檢測FFPE樣本中KRAS突變情況,同時在自建的多重數字PCR平臺上檢測患者血漿DNA中KRAS的突變情況(表3)。在15例PDAC患者中,組織KRAS突變的陽性率為100%,ARMs檢測血漿cfDNA的陽性率為20%,數字PCR的檢測結果則為53%。6例患者(40%)的血漿cfDNA結果與組織完全匹配,8例患者未在外周血中發現KRAS相關突變。患者7和患者12的組織結果與血漿cfDNA結果有差異。使用多重數字PCR在患者7的外周血中檢測出低豐度的G12S突變型,而ARMs方法無論在組織還是cfDNA中均未檢測出該突變?；颊?2的組織中存在G13D突變,但是在血漿中兩種方法均未發現該突變,且ARMs未在cfDNA中檢測出低豐度的G12D突變。

CaseNo.TNMTumortissueDNAARMsPlasmacfDNAARMsdPCR1ⅡAG12DNG12D(1.32%)2ⅡAG12DNN3ⅡBG12VG12VG12V(4.52%)4ⅡAG12VNG12V(0.92%)5ⅡBG12R,G12CNN6ⅡAG12RNN7ⅡBG12DG12DG12s(0.82%),G12D(12.24%)8ⅡAG12RNN9ⅡBG12VG12VG12V(6.56%)10ⅡBG12RNN11ⅡBG12VNG12V(1.36%)12ⅡAG12D,G13DNG12D(0.56%)13ⅡBG12DNN14ⅡAG12DNG12D(0.09%)15ⅡBG12VNN

N:Non-amplified.

討 論

本實驗使用的液滴式數字PCR系統在2個反應孔中實現了對外周血中KRAS基因第2外顯子12、13密碼子共7個突變位點進行絕對定量分析的目的。經過初步的性能驗證結合實際標本的檢測,我們認為多重數字PCR具備對多個突變位點在單孔中進行同時分析的能力,特異性、敏感度和重復性均可滿足臨床需求。

多重數字PCR在雙重PCR的基礎上通過改變探針的類型和濃度以達到在二維坐標上區分不同基因型的目的。由于數字PCR具備無限稀釋分液的能力,確保了單個液滴中僅包含一條模板及反應體系。在單個反應液滴中,如果探針與模板匹配,隨著PCR反應循環數的增加可使液滴發出可檢測到的熒光,且該熒光強度與探針的濃度成正比。通過FAM和VIC兩種熒光標記同一種基因型,可使得液滴具備不同波段的熒光信號,此類液滴通常位于二維坐標軸的右上方(如體系1中的G12R和體系2中的G12A),具體位置隨著探針濃度的變化而改變。因此,按照此理論對探針的濃度和標記物類型進行調整,最高可建立十重數字PCR的檢測體系。

LOB的確立依賴于大量以野生型為模板進行的空白測試結果的累積。通?？晒┻x擇的野生型模板類型包括碎片化的質?；蚣毎?、正常人cfDNA以及合成短序列等。實驗結果顯示,7個突變型均存在一定數量的“假液滴”作為雜音存在于檢測體系中。在兩個反應體系中發現G12D和G13D的LOB均顯著高于所在體系中其他突變類型,可能與加入探針的終濃度相關(G12D∶0.2 μmol/L,G13D:0.25 μmol/L,G12S:0.2 μmol/L)。過高的探針濃度會提高與野生型模板錯配的概率,最終表現為LOB升高。相對而言,由于雙重PCR僅需添加兩種類型的探針,此現象并不常見。本研究對LOB實驗和驗證的結果提示,無論是樣本的濃度還是類型均不會明顯改變LOB值,該結論在Valerie等[12]的研究中也被證實。因此,后續類似項目可考慮使用更易獲得、制備方便且穩定的質粒作為質控品。

通過多重數字PCR檢測15例PDAC患者cfDNA與ARMs方法檢測組織標本的結果比對發現,數字PCR在檢測血漿cfDNA時優于ARMs方法。以數字PCR的檢測結果作為參考,ARMs檢測的cfDNA陽性患者的最低檢出豐度為0.92%。與之相比,數字PCR的最低檢出豐度達到0.09%。以組織結果為金標準,在數字PCR檢測出的cfDNA陽性標本中有3例的ARMs檢測結果為陰性。因此認為,目前ARMs方法的靈敏度無法完全滿足血漿cfDNA的檢測需求。

個體間對核酸清除能力的差異、腫瘤負荷、腫瘤分期、腫瘤類型均會影響cfDNA在外周血能夠被檢出的水平。在本研究的15例Ⅱ期的PDAC患者的cfDNA中,KRAS突變的檢出率為53%?；颊?出現外周血和組織結果不匹配的情況,通過數字PCR檢測出組織中未發現的KRAS G12S突變。對于上述情況可能的解釋是單一組織樣本不能反映整個腫瘤組織的突變狀態,腫瘤亞克隆被認為廣泛存在于腫瘤組織中?！耙后w活檢”的優勢之一便是當游離核酸釋放入血后獲取的血液樣本囊括了來自于腫瘤組織的大部分信息,這一觀點在近期的一些研究中也有類似報道[15-16]。患者12的外周血中并未能檢測出組織中發現的G13D突變,經過復檢后確認組織和外周血的結果。為確認組織中G12D和G12D的豐度,使用數字PCR檢測該樣本發現G12D和G13D的豐度分別為12.1%和1.21%。G13D較低的豐度提示腫瘤灶內該類型的突變要遠低于G12D,游離到外周血的cfDNA可能因被降解而無法被檢測到。因此,外周血cfDNA的結果也并不能夠反映腫瘤灶的全部信息。

數字PCR系統具有高靈敏度和特異性,其檢測能力已得到廣泛認可,同時參照2013年數字PCR的MIQE導則也可逐步規范整個體系的操作步驟[14]。但是,在實際使用中亟需解決以下2個問題:(1) 缺乏對測試結果的標準化解讀模式(更多依賴于個人經驗);(2) 目前的檢測結果與具體病例之間很難建立起有效聯系。針對前者可以通過累積大量數據以提升整個系統的檢測性能(如LOB、最低檢測限、臨床決定水平等)。針對后者則需要將“液體活檢”理論和數字PCR技術結合,探索其在腫瘤早期診斷、治療評估、復發監測等領域的應用前景。

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KRAS related mutations detected by multiplex digital PCR

WU Sheng-chao1, HUANG Fei1, ZHAO Ying1, YU Qian1, HAN Xu2, WANG Bei-li1, ZHANG Chun-yan1, GUO Wei1, LOU Wen-hui2, PAN Bai-shen1△

(1DepartmentofClinicalLaboratory,2DepartmentofSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To establish amultiplex digital PCR panel detecting 7 most common mutations in codon 12,13 of KRAS exon 2 from plasma cell-free DNA (cfDNA). Methods Plasmids prepared were applied to the establishment of multiplex digital PCR panels.We regarded sensitivity,specificity and dynamic range as main parameters to evaluate the performance.Plasma cfDNA and tissue sample from 15 resectable patients of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) were tested with dPCR and ARMs respectively and consistency between these two methods was also evaluated. Results Our self-built multiplex dPCR showed a good linearity performance in the dynamic range of 0.01%-10%.The sensitivity of two panels reached 0.025% and 0.043%,respectively.Among 15 PDAC patients,the consistency between plasma cfDNA given by digital PCR and tissue samples was 40%,while the result was 20% when we used ARMs to detect plasma cfDNA.The lowest abundance of KRAS mutations in plasma cfDNA among 15 PDAC patients was 0.09% according to digital PCR. Conclusions Multiplex digital PCR system shows high sensitivity and specificity in detecting and quantifying mutations of KRAS simultaneously in cfDNA.

multiplex digital PCR; plamsa cell-free DNA; KRAS

國家自然科學基金面上項目(81572064);上海市衛生計生系統重要薄弱學科建設項目(2015ZB0201)

R446.11+9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.011

2016-01-11;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81572064) and the Key Developing Disciplines of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2015ZB0201).