不同豬種初乳外核體中免疫相關miRNA的鑒定

顧以韌，李智，梁艷，楊雪梅，陶璇，鐘志君，陳曉暉，呂學斌

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.瀘縣畜牧局，四川瀘州646100）

不同豬種初乳外核體中免疫相關miRNA的鑒定

顧以韌1，李智2，梁艷1，楊雪梅1，陶璇1，鐘志君1，陳曉暉1，呂學斌1

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.瀘縣畜牧局，四川瀘州646100）

母乳是嬰兒最重要的食物來源，對嬰兒的健康發育特別是后天免疫的形成有著至關重要的作用，乳質量形成的分子基礎已成為當今生物學科領域研究的熱點之一。試驗采用第2代高通量測序技術（Solexa測序）對大約克夏豬和梅山豬初乳外核體中miRNA進行了鑒定，結果發現，免疫相關的miRNA在初乳中呈現富集現象，且梅山豬初乳外核體中的數量極顯著高于大約克夏豬（P＜0.01），而在大約克夏豬個體間差異不顯著，說明梅山豬對疾病的抵抗力高于大約克夏豬。此試驗可為深入研究母乳在嬰兒免疫系統發育過程中的基本功能提供基礎數據。

豬；初乳；外核體；miRNA

母乳有初乳和常乳之分，初乳比常乳具有更高的營養價值，它傳遞了被動免疫保護以及母源的代謝調節信號，對新生后代早期的存活和生長發育起著重要的作用[1]。畜牧業生產中，吃不到母乳的幼畜很難成活，而吃不足母乳或吃不到初乳者抗病力弱，更易患病。目前，對影響乳質量的常規成分已經有了較為系統和深入的研究，但在母乳提高機體免疫能力、增強對疾病抵抗能力以及在幼兒消化系統中存在抗性的分子機理的研究還遠不夠系統和深入，且主要集中關注DNA和mRNA水平的蛋白編碼基因。miRNA是一類內源性的、長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA，它們廣泛存在于多種真核生物體中，通過與靶mRNA的3'UTR互補結合，可降解該mRNA或抑制其翻譯，其在基因表達調控、生物個體發育、代謝、疾病發生和免疫調控等生理過程中均發揮著重要的作用[2-3]。然而，乳成分十分復雜，并非乳中所有的miRNA在進入新生兒消化系統后均能被消化吸收。研究認為乳中的miRNA可分為兩部分：一部分為游離于乳汁中的，沒有任何保護的裸露的miRNA；另一部分是被稱作外核體（Exosome）包被的miRNA。Exosome是一類直徑約30～100 nm廣泛存在各種體液中的小囊泡體，可以保護其中包被的miRNA、mRNA和蛋白質，還能參與細胞之間信息的傳遞和物質的交換，甚至在植物性食品和人體之間進行交流[4-6]。當母乳進入新生兒的胃內以后，那些裸露于乳汁中的、沒有外核體保護的miRNA將被胃內極酸的微環境迅速降解，而不能被新生兒的消化系統吸收利用，只有那些被外核體包被的miRNA才能在胃內極酸環境下避免被降解，最終被新生兒消化系統吸收，從而對新生兒免疫系統的完善、保持機體正常發育起重要調控作用。故研究母乳外核體中的miRNA比僅籠統的研究全乳中miRNA更能準確反映母乳是如何調控新生兒免疫系統發育的。采用Solexa測序技術對中外不同豬種初乳外核體中miRNA進行了鑒定，并篩選出與免疫功能密切相關的miRNA，有助于探明不同豬種初乳在調控仔豬機體免疫方面存在明顯差異的分子機制，并為深入研究乳質量形成的分子基礎提供必要的基礎信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣本采集

選取健康狀況良好的3頭經產大約克夏母豬和1頭梅山母豬，在分娩時立刻采集試驗所需的母豬乳樣本，每頭豬采集2份母乳樣本（每份3～5 mL），并將其保存在液氮中用于后續試驗。試驗時間為2014年6—12月，試驗地點為四川省畜牧科學研究院種豬科研基地。

1.2 外核體沉淀及RNA提取

首先吸取母乳1.5 mL 2 000 g/min離心10 min去除乳中的脂肪球，上清液再經過12 000 g/min離心30 min去除細胞碎屑等雜質，然后按照2∶1的比例加入ExoQuick Exosome Precipitation Solution（SBI,CA, USA）4℃孵育12 h后進行1 500 g/min離心30 min獲得Exosome顆粒沉淀，用250 μL左右的RNAfree水將Exosome沉淀溶解后再用TRIzol?LS Reagent（美國Invitrogen公司）按照說明書從Exosome中提取高質量的RNA。提取得到的該RNA樣品經過AgilentBioanalyzer 2100檢測后用于下游試驗。

1.3 miRNA的高通量測序及免疫密切相關的miRNA的篩選

采用美國Illumina公司開發的高通量測序技術對通過上述方法提取得到的母乳RNA樣品進行miRNA深度測序，測序結果經過數據初處理和生物信息學分析后鑒定出豬乳外核體中的miRNA，該部分由美國LC公司完成。對鑒定出的miRNA結合Pathway Central database（SABiosciences,MD,USA）（http://www.sabiosciences.com/mirna_pcr_array.php）數據庫中對miRNA功能的注釋，在豬乳外核體中篩選與免疫功能密切相關（與數據庫中的Immunopathology,InflammatoryResponseandAutoimmunity,T-Cell&BCell Activation 3部分功能相對應）的miRNA。

1.4 統計方法

試驗結果采用Sigmaplot12.0的x2-test程序進行統計分析。

2 結果與討論

由圖1可知，在3頭大約克夏豬母乳外核體中共檢測到的miRNA數量分別為147、153和159種，其中免疫相關的miRNA（SABiosciences database）數量分別為52、56和56條，分別占鑒定的miRNA總數的35.37%、36.60%和35.22%。梅山豬母乳外核體中共檢測到miRNA 146種，其中免疫相關的miRNA數量為81種，占被鑒定的miRNA總數55.48%。以上結果說明，無論在大約克夏豬還是梅山豬中，免疫相關的miRNA在其初乳外核體中均存在明顯的富集現象，這也與我們之前對不同泌乳期豬乳外核體中miRNA的鑒定結果一致[7]。這些免疫相關的miRNA在初乳中由于受到外核體的保護而使其能夠在外界極端惡劣條件下不被降解，其調控功能主要涉及到免疫病理、炎癥反應和自身免疫、T細胞和B細胞活性等方面，因此初生仔豬及時吮吸初乳可促進自身機體免疫系統的快速建立并迅速增強其對疾病的抵抗能力。顯著性統計結果顯示，免疫相關的miRNA在梅山豬初乳外核體中的數量極顯著高于大約克夏豬（P＜0.01），而在大約克夏豬個體間差異不顯著，這說明同等情況下梅山豬仔豬可能比引進豬種—大約克夏豬更早建立起完善的自身免疫系統，其對疾病的抵抗力也高于大約克夏豬。我們推測豬乳中的這些與免疫相關的miRNA是通過仔豬消化道被吸收，進而對幼畜的免疫系統發揮調控功能的，這也與我國梅山豬的抗逆性優于國外豬種大約克夏豬的種質特性相一致。本研究不僅可為乳的研究提供新的思路，而且可為豬的抗病育種提供可靠的基礎數據。

圖1 大約克夏豬和梅山豬母乳外核體中免疫相關miRNA

[1]Paramasivam K,Michie C,Opara E,et al.Human breast milk immunology:a review[J].Int J Fertil Womens Med,2006,51:208-217.

[2]Bartel D P.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136:215-233.

[3]Xiao C,Rajewsky K.MicroRNA control in the immune system: basic principles[J].Cell,2009,136:26-36.

[4]Mathivanan S,Ji H,Simpson R J.Exosomes:extracellular organelles important in intercellular communication[J].J Proteomics,2010, 73:1907-1920.

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[6]Admyre C,Johansson S M,Qazi K R,et al.Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk[J].J Immunol,2007,179:1969-1978.

[7]Gu Y,Li M,Wang T,et al.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[J].PloS ONE, 2012,7(8):e43691.

（編輯：富春妮）

Identification of Immune-Related MicroRNA in Porcine Colostrum Exosomes of Yorkshire and Meishan Pigs

GU Yiren1,LI Zhi2,LIANG Yan1,YANG Xuemei1,TAO Xuan1,ZHONG Zhijun1,CHEN Xiaohui1,LV Xuebin1
(1.Sichuan Aniamal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Lu County Animal Husbandry Bureau,Luzhou 646100,China)

Breast milk,the primary source of nutrition for newborns,plays important roles in infant's growth and is crucial for the development of the post-natal immune system.It is of great interest to decipher the molecular mechanism of breast milk quality which is beneficial for immune diseases researches.Here,we analyzed the immune related miRNA in porcine colostrum by a deep sequencing and found that immune related miRNAs are present and enriched in breast milk exosomes.Notably,these exosomal immune related miRNAs are present in higher numbers in the colostrums of Meishan pigs than the Yorkshires pigs(P＜0.01).These observations are a prelude to in-depth investigations of the essential roles of breast milk in the development of the infant's immune system.

pig;colostrum;exosome;miRNA

S828

A

1002-1957(2016)02-0060-02

2016-03-10

國家自然科學基金（31301942）；四川省畜牧科學研究院基本科研業務費（SASA2014A08）；國家生豬產業技術體系—綜合試驗站（CARS-36）

顧以韌（1980-），男，江蘇響水人，副研究員，博士，研究方向為動物遺傳育種.E-mail:guyiren1128@163.com

呂學斌（1965-），男，研究員，博士，研究方向為豬的遺傳育種.E-mail:lvxuebin@21cn.com