五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞氧化損傷的影響

楊杰，衛東鋒，王文瀟，程衛東

1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；2.蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700

五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞氧化損傷的影響

楊杰1，2，衛東鋒3，王文瀟2，程衛東1

1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；2.蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700

目的 觀察五指毛桃藥物血清對老齡小鼠衰老所致脾淋巴細胞氧化損傷的影響，探討其作用機制。方法 將40只老齡小鼠隨機分為空白對照組和五指毛桃高、中、低劑量組，分別給予0.9%氯化鈉溶液和6.6、4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，測定脾臟指數，確定五指毛桃水提物的最佳劑量，采用MTT法確定最佳劑量藥物血清干預老齡小鼠脾淋巴細胞增殖的最佳稀釋濃度及最佳作用時間。使用最佳稀釋濃度藥物血清作用老齡小鼠脾淋巴細胞48 h后觀察衰老細胞陽性率，檢測細胞內總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量。結果 與空白對照組比較，藥物組老齡小鼠脾臟指數均明顯提高（P＜0.05，P＜0.01)，以中劑量組效果最佳；五指毛桃藥物血清促進老齡小鼠脾淋巴細胞增殖的最佳濃度為20%，最佳作用時間為48 h。20%五指毛桃藥物血清明顯降低衰老細胞陽性率（P＜0.01)，提高老齡小鼠T-SOD活性，降低MDA和ROS含量（P＜0.05，P＜0.01）。結論 五指毛桃藥物血清能夠提高老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性，其機制與降低衰老細胞陽性率、增強細胞抗氧化能力有關。

五指毛桃；藥物血清；脾淋巴細胞；衰老；氧化損傷；老齡小鼠

五指毛桃以桑科榕屬植物粗葉榕Ficus hirta Vahl.的干燥根入藥，其味甘、辛，性平，具有補氣健脾、利濕舒筋等功效，常用于治療肺脾氣虛、風濕痹痛、肺癆咳嗽等。因其與黃芪作用相當，且主要產于我國嶺南地區，故又稱“南芪”。以往研究發現，南芪、北芪均有增強小鼠細胞免疫力的作用，但南芪作用效果較為顯著[1]。五指毛桃中活性成分如黃酮、多糖、多酚、氨基酸均有較強清除自由基的作用，且其中黃酮、氨基酸和多酚相對于其他植物抗氧化活性更強[2]，對機體氧化損傷具有明顯的保護作用。本實驗采用血清藥理學方法，觀察五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞氧化損傷的影響，為五指毛桃的臨床應用及藥物研發提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級昆明種青齡小鼠50只，6月齡，雌雄各半，體質量（20±2）g；清潔級昆明種老齡小鼠60只，18月齡，體質量（20±2）g，雌雄各半。均由蘭州大學醫學動物實驗中心提供，許可證號SCXK（甘）2009-0004。飼養溫度為（20±2）℃，12 h晝夜交替動物房中，自由進食。

1.2 藥物

五指毛桃由南方醫科大學中醫藥學院程衛東教授提供并鑒定。五指毛桃水提物制備：將藥材加入適量水中浸泡0.5～1 h，煎煮3次，第1次1.5 h，第2次1 h，第3次0.5 h，合并3次濾液，將所得濾液濃縮至1 g原藥材/mL，4 ℃保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

四甲基偶氮唑鹽（MTT）、刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖，美國Sigma公司；RPMI-1640培養基，恒生生物工程有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS），天津化學試劑一廠；EZ-SepTM小鼠淋巴細胞分離液，深圳達科為生物技術有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，碧云天生物技術研究所；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、細胞內活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所。CO2培養箱（日本SANYO公司），680型酶標儀（美國Bio-Rad公司），XL型流式細胞儀（美國貝克曼COULTER公司），JY92-2D超聲細胞粉碎機（寧波新芝公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及藥物血清和脾淋巴細胞懸液制備

將40只老齡小鼠隨機分為空白對照組和五指毛桃高、中、低劑量組，每組10只。空白對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，藥物組按體質量分別給予高、中、低劑量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌胃，1次/d，連續15 d。末次給藥后，摘取脾臟，計算脾臟指數。根據脾臟指數選擇五指毛桃水提物最佳劑量（4.4 g/kg）作用于青齡小鼠，1次/d，連續15 d，末次給藥2 h后，制備藥物血清[3]。

將青齡小鼠和老齡小鼠脫頸處死，無菌取脾臟，嚴格按照EZ-SepTM小鼠淋巴細胞分離物說明書操作提取脾淋巴細胞，各加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，分別調整為所需濃度，制備青齡小鼠和老齡小鼠的脾淋巴細胞懸液。

2.2 檢測指標

2.2.1 五指毛桃藥物血清與脾淋巴細胞增殖時效和量效關系測定 將上述制備的老齡小鼠脾淋巴細胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL。將“2.1”項中制備的各組藥物血清用完全RPMI-1640培養液稀釋為2.5%、5%、10%、20%、40% 5個濃度。每個濃度設8個復孔，同時設不加藥物血清的老齡組和青齡組作為對照，分別培養24、48、72 h后，加入濃度5 g/mL MTT 10 μL，于CO2培養箱中繼續培養4 h后，每孔加入100 μL 10%SDS，37 ℃過夜后搖勻，于酶標儀570 nm處測定OD值。根據MTT結果選擇藥物血清的最佳稀釋濃度和培養時間。

2.2.2 衰老脾淋巴細胞增殖活性測定 取各組脾淋巴細胞按照細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行操作。鏡下隨機選擇5個視野，按公式計算衰老細胞陽性率。衰老細胞陽性率（%）＝衰老細胞數÷總細胞數×100%。

2.2.3 脾淋巴細胞總超氧化物歧化酶、丙二醛水平測定 將“2.1”項中收集的老齡小鼠脾淋巴細胞與最佳稀釋濃度的藥物血清培養“2.2.1”項中確定的最佳培養時間后，收集細胞，用超聲波細胞破碎儀在冰上破碎細胞，嚴格按照T-SOD和MDA試劑盒說明書進行操作。

2.2.4 脾淋巴細胞活性氧水平測定 將“2.1”項收集的老齡小鼠脾淋巴細胞與各組藥物血清共同培養。收集的細胞嚴格按照ROS試劑盒說明書處理后，用流式細胞儀于488 nm激發波長、525 nm發射波長處檢測其熒光強度。

3 統計學方法

表4 各組小鼠脾淋巴細胞T-SOD活性和MDA含量比較（s）

表4 各組小鼠脾淋巴細胞T-SOD活性和MDA含量比較（s）

組別 n劑量/（g/kg）T-SOD/（U/mg）MDA/（nmol/mg）青齡組 8 7.51±1.02 1.21±0.46老齡組 8 2.52±0.53**2.65±1.05**空白血清組 8 2.46±0.51 2.35±0.79*五指毛桃藥物血清組8 6 5.65±0.84##1.19±0.67#

4 結果

4.1 五指毛桃水提物對老齡小鼠脾臟指數的影響

與空白對照組比較，五指毛桃高、中劑量組老齡小鼠脾臟指數明顯提高，且中劑量組效果顯著（P＜0.01），見表1。故選用中劑量五指毛桃水提物給予青齡小鼠灌胃制備藥物血清。

表1 各組老齡小鼠脾臟指數比較（±s）

表1 各組老齡小鼠脾臟指數比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數 劑量/（g/kg） 脾臟指數/（mg/g）空白對照組 10 2.74±0.73五指毛桃高劑量組 10 6.6 3.28±0.63*五指毛桃中劑量組 10 4.4 3.49±0.58**五指毛桃低劑量組 10 2.2 2.79±0.61

4.2 五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

與老齡組比較，稀釋濃度為10%、20%、40%五指毛桃藥物血清均能明顯提高老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性（P＜0.05，P＜0.01），并呈現一定的時-效和量-效關系。隨著細胞培養時間的延長，脾淋巴細胞的增殖活性呈現先升后降的現象；空白血清稀釋濃度為20%和40%時，也可提高老齡小鼠脾淋巴細胞細胞增殖活性，但仍比五指毛桃藥物血清組水平低。與空白血清組比較，培養48 h，稀釋濃度為20%五指毛桃藥物血清對脾淋巴細胞增殖的刺激效果最佳（P＜0.01），見表2。因此，將稀釋濃度為20%、培養時間為48 h的五指毛桃藥物血清作為后續實驗研究的條件。

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖活性比較（±s）

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖活性比較（±s）

注：與同一時點老齡組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同一濃度空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n24 h 48 h 72 h青齡組 81.01±0.19**1.23±0.28**1.08±0.16**老齡組 80.59±0.14 0.65±0.06 0.57±0.05 2.5%空白血清組 80.57±0.07 0.69±0.04 0.60±0.03 5%空白血清組 80.58±0.04 0.63±0.06 0.57±0.05 10%空白血清組 80.60±0.05 0.68±0.05 0.61±0.04 20%空白血清組 80.68±0.09 0.83±0.09**0.62±0.08 40%空白血清組 80.65±0.04 0.78±0.08*0.64±0.04*2.5%五指毛桃藥物血清組80.62±0.09 0.65±0.05 0.65±0.09 5%五指毛桃藥物血清組 80.66±0.14 0.72±0.09 0.67±0.10 10%五指毛桃藥物血清組80.72±0.07##0.79±0.06#0.71±0.05#20%五指毛桃藥物血清組80.79±0.02##1.19±0.13##0.98±0.15##40%五指毛桃藥物血清組80.74±0.07##0.90±0.21#0.79±0.08#

4.3 五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾衰老細胞的影響

老齡組衰老細胞陽性率為23.80%，青齡組衰老細胞陽性率為2.31%。與青齡組比較，老齡組脾衰老細胞顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清作用后老齡小鼠脾淋巴細胞衰老細胞陽性率顯著降低（P＜0.01）；老齡組與空白血清組比較差異無統計學意義。結果見表3。

表3 各組小鼠脾衰老細胞陽性率比較（±s）

表3 各組小鼠脾衰老細胞陽性率比較（±s）

注：與青齡組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（下同）

組別 n 劑量/（g/kg） 陽性率/%青齡組 8 2.31±0.45老齡組 8 23.80±1.59**空白血清組 8 22.95±1.02五指毛桃藥物血清組 86 15.73±0.81##

4.4 五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞總超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影響

與青齡組比較，老齡組小鼠脾淋巴細胞T-SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清組老齡小鼠體外脾淋巴細胞總T-SOD活性顯著升高（P＜0.01），脾淋巴細胞內MDA含量顯著降低（P＜0.05）；與老齡組比較，空白血清組脾淋巴細胞內MDA含量明顯降低（P＜0.05），但仍比五指毛桃藥物血清組水平高。結果見表4。

4.5 五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞活性氧水平的影響

與青齡組比較，老齡組脾淋巴細胞中ROS含量顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清組老齡小鼠脾淋巴細胞中ROS含量明顯降低（P＜0.05）；空白血清組與老齡組比較差異無統計學意義。結果見表5。

表5 各組小鼠脾淋巴細胞ROS含量比較（s）

表5 各組小鼠脾淋巴細胞ROS含量比較（s）

組別 n劑量/（g/kg） ROS/熒光強度值青齡組 8 6.73±0.45老齡組 8 12.20±1.69**空白血清組 8 11.72±1.76五指毛桃藥物血清組 86 9.74±0.61#

5 討論

五指毛桃始載于清代何克諫《生草藥性備要》“五爪龍，根治熱咳痰火。”因性喜溫暖濕潤的環境，主要生長于我國熱帶和亞熱帶地區，是一種藥食兩用的植物，其根除用來煲湯還被開發成多種藥膳及保健品，在廣東、廣西等地廣泛使用。研究表明，五指毛桃可增加大黃所致脾虛模型小鼠的免疫器官胸腺、脾臟的質量[4]，且其有效成分補骨脂素具有免疫調節、抗菌、抗病毒、抗凝血及抑制腫瘤等作用[5]。免疫系統參與機體正常的老化過程，是機體衰老的主要調節系統之一。而T淋巴細胞是機體重要的免疫效應細胞，除具有清除外源性病原微生物的作用外還可清除體內衰老或畸變細胞，其與衰老之間關系研究近年來備受關注[6]。脾臟是人體重要的免疫器官，能產生大量T淋巴細胞，為周圍淋巴器官正常發育和參與機體免疫所必需，而脾臟指數是直接反映機體免疫狀態的重要參數。本實驗使用高、中、低劑量五指毛桃水提物給予老齡小鼠灌胃，測定小鼠脾臟指數，旨在確定五指毛桃抗細胞衰老的有效性。并通過組間比較，確定五指毛桃水提物中劑量為最佳劑量組，再采用中劑量五指毛桃水提物給予青齡小鼠灌胃，制備藥物血清，為后續細胞實驗做準備。

衰老是一種復雜的生理、病理變化過程，此過程包括器官、細胞和分子等功能的整體衰退。機體在氧化代謝過程中會產生各種自由基。自由基一旦過量，超過機體自身的清除能力，就會引起脂質、蛋白質、RNA和DNA的氧化損傷，而這些損傷會導致突變、癌變和衰老的發生[7]。SOD是一種自由基防御酶，有助于清除人體因代謝失衡產生過多的氧自由基，常作為器官氧化損傷程度評價的重要指標。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的產物且具有細胞毒性，其含量可間接反映機體內細胞氧化損傷程度。有研究表明，老齡鼠與青齡鼠比較，SOD活性明顯下降而MDA含量明顯升高[8]。本實驗結果顯示，老齡小鼠脾淋巴細胞中SOD活性較青齡小鼠低，MDA含量較青齡小鼠高，與以往研究相符。經五指毛桃藥物血清作用后，SOD活性顯著升高，且MDA含量明顯降低，表明五指毛桃具有明顯抗氧化損傷的作用。

ROS是生物有氧代謝過程中的產物，過高的ROS水平會對細胞和基因結構造成損害。有研究表明，ROS可造成線粒體損傷并引起不可逆性的生長抑制，最終導致細胞衰老、死亡[9]。本實驗采用流式細胞儀檢測發現，老齡小鼠脾淋巴細胞中ROS熒光強度值明顯比青齡小鼠高，五指毛桃藥物血清作用后可明顯降低老齡小鼠體內ROS水平，說明其能發揮良好的抗氧化作用。

綜上所述，本實驗研究表明，五指毛桃藥物血清對老齡小鼠因衰老導致的脾淋巴細胞氧化損傷具有明顯保護作用，其機制與減少衰老細胞數量、提高SOD活性、降低細胞內ROS和MDA含量有關。但其能否在人體內更好地發揮抗氧化作用及發揮該作用的有效劑量范圍仍需要進一步研究。

[1] 周添濃,王艷,唐立海,等.南芪北芪抗應激與免疫調節作用的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(1)：15-18.

[2] 李南薇,黃燕珍.五指毛桃功能性成分抗氧化活性研究[J].食品工業, 2013,34(6)：127-130.

[3] 邢文婷,張李鋒,程衛東,等.含紅芪和含黃芪的補中益氣湯藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞抗氧化損傷作用的比較[J].中藥材,2014,37(2)：299-302.

[4] 羅騫,蘇芬麗,王姿媛,等.五指毛桃對大黃型脾虛模型小鼠補益作用研究[J].新中醫,2013,45(9)：152-154.

[5] 段菊屏.中藥復方及單味五指毛桃根中補骨脂素大鼠體內藥動學研究[J].中國醫藥導報,2011,8(4)：29-31.

[6] 劉玉華,邱玉華.免疫老化與T淋巴細胞功能性分子的改變[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(7)：668-670.

[7] BENAMEUR L, CHARIF N, LI Y, et al. Toward an understanding of mechanism of aging-induced oxidative stress in human mesenchymal stem cells[J]. Biomed Mater Eng,2015,25(1)：41-46.

[8] UZUN D, KORKMAZ G G, SITAR M E, et al. Oxidative damage parameters in renal tissues of aged and young rats based on gender[J]. Clinical Interventions in Aging,2013,8：809-815.

[9] ZIEGLER D V, WILEY C D, VELARDE M C. Mitochondrial effectors of cellular senescence：beyond the free radical theory of aging[J]. Aging Cell,2015,14(1)：1-7.

Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte in Aged Mice

YANG Jie1,2, WEI Dong-feng3, WANG Wen-xiao2, CHENG Wei-dong1(1. Institute of Traditional

Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. School of Basic Medical Science of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen lymphocyte due to aging in aged mice; To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly divided into control group and high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9% sodium chloride solution for gavage, while high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6, 4.4, and 2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice. The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells, the activity of T-SOD and the contents of MDA and ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h. Results Compared with the control group, the spleen index was significantly improved in high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups (P<0.05, P<0.01). 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly decrease the positive rate of senescent cells (P<0.01), improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and ROS (P<0.05, P<0.01). Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.

Ficus Hirta; drug-containing serum; spleen lymphocytes; aging; oxidative damage; aged mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0052-04

2015-04-12）

（

2015-10-23；編輯：華強）

國家自然科學基金面上項目(81373806)；甘肅省中醫藥管理局普通課題(GZK-2012-43)

程衛東，E-mail：chengweidong888@sina.com