一例嚴重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷

趙軍，朱玲，徐志文

（四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心，四川成都611130）

一例嚴重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷

趙軍，朱玲，徐志文

（四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心，四川成都611130）

2015年7月，四川眉山某豬場發生15日齡左右仔豬大面積死亡，臨床癥狀表現為高熱、抽搐、呼吸急促、精神沉郁、不采食等，病程短，發病1 d后死亡，呈現典型病毒病癥狀。發病率達80%，死亡率達100%。剖檢病死豬發現全身淋巴結出血，肺瘀血、水腫，打開顱腔后發現腦和脊髓膜充血出血，通過流行病學和實驗室診斷確診為偽狂犬病和流行性乙型腦炎混合感染。

豬乙型腦炎；豬偽狂犬病；混合感染；診斷

流行性乙型腦炎是由黃疸病毒科乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的蚊媒性嚴重危害人畜健康的急性傳染病，主要通過蚊叮咬吸血傳播。臨床表現為高熱、狂暴或沉郁、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激等神經癥狀，具有明顯的季節性和一定的地理分布區域，多發生于蟲蚊較多的夏秋季節，屬于自然疫源性疾病[1-2]。豬在乙型腦炎的傳播中起著很重要的作用，被認為是其擴大傳播的主要容器[3]。乙型腦炎能引起母豬繁殖障礙，懷孕母豬流產、產死胎或木乃伊胎，公豬急性睪丸炎，嚴重時喪失配種能力[4]。

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的一種以發熱、腦脊髓炎為主要癥狀的急性高度接觸性傳播疾病，新生仔豬出現神經癥狀，發病率和死亡率可達100%[5]；成年豬感染后表現為一過性發熱，打噴嚏，多可耐過，呈隱性感染，但造成長期帶毒、排毒，成為傳染源，嚴重危害養豬業[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2015年7—8月在四川農業大學動物生物技術中心進行。

1.2 病料采集

本次通過臨床診斷和剖解病理變化的觀察，對疾病初步判定為乙腦和偽狂犬病，針對該兩種疾病無菌采集相關病變較嚴重的器官、組織。分別采集兩頭病死豬腦、扁桃體、淋巴結、肺臟、脾臟、肝臟，分別編號為1號、2號；同時采集其鼻腔分泌液，分別編號1號、2號，帶回實驗室進行病原診斷[7]。

1.3 菌種及主要試劑

大腸桿菌DH5α由四川農業大學動物生物技術中心保存。PMD19-Tsimple載體購自寶生物工程（大連）有限公司；TaqDNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker DL 2 000、DNA純化回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物合成

引用文獻[8]乙腦病毒引物序列，根據GenBank中收錄的偽狂犬病病毒（PRV）全基因序列經DNAStar進行同源性分析，用Primer 5.0設計引物，在用NCBI在線BLSAT對引物的特異性進行驗證，設計上、下游引物，分別是PRV-E1：5'-ACCTGAGCGTCC TGCGG-3'，PRV-E2：5'-CCGTTGTGGGTCATCACGA G-3'，擴增產物長度為544 bp；PRV-GE1：5'-CGGG ATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3'，PRV-GE2：5'-CGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3'，擴增產物大小為1 754 bp；JEV-P1：5'-GCTCTTATCACGT TCTTCAAGTTTAC-3'，JEV-P2：5'-TTCCCAGACAAT TAAAACTGTAAGC-3'，擴增產物長度為754 bp。引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.5 病毒總RNA的抽提及PCR擴增

組織樣品分別放入勻漿器里，編號后加1 mL Trizol裂解液進行勻漿，勻漿充分后室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液，加入200 μL氯仿迅速振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心15 min；向最后獲得的上清液中加入等量異丙醇沉淀RNA，輕輕搖晃混勻，室溫作用10 min后，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風干，溶解于40 μL無Rnase水中，-20℃保存備用。按照寶生物工程（大連）有限公司RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，將反轉錄產物于-20℃保存備用。以P1、P2為檢測引物PCR反應程序為：95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃終延伸10 min。以本實驗室建立的豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測方法分別進行相關病原的檢測。反應體系為ddH2O 3 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 病毒總DNA的抽提及PCR擴增

組織樣品放入勻漿器，勻漿充分后室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液500 μL，加入500 μL飽和酚迅速振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液，向獲得的上清液中加入200 μL氯仿、飽和酚搖勻靜置5 min，輕輕搖晃混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清液，向上清液中加400 μL的氯仿搖勻靜置5 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加2倍體積的異丙醇輕輕搖勻，放入-20℃凍20 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風干，溶解于40 μL ddH2O中，-20℃保存備用。以E1、E2為檢測引物PCR反應程序為：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃終延伸10 min。反應體系為ddH2O 2 μL La Taq DNA聚合酶0.1 μL dNTP Mixture 1 μL，2×GC Buffer II 5 μL，上下游引物各0.5 μL模板1 μL，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 JEV PrM/c基因和PRV-gE全基因的克隆與序列測定

用膠回收試劑盒純化PCR產物，按照PMD19-Tsimple載體試劑盒說明書連接后將篩選的陽性重組質粒送寶生物工程（大連）有限公司測序。

使用DNAStar軟件[6]對克隆獲得的PRV gE全基因序列進行拼接。從NCBI的GenBank中下載部分世界毒株序列作為參考與試驗獲得的序列比較。同時用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對序列的同源性進行確認。多重序列的對齊由ClustalW完成。采用MEGA6.0中的近鄰結合法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹用于PCV2全基因的分子遺傳進化分析。所有分析都是在使用Kimura-2參數模型下對JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）而進行的。

2 結果

2.1 臨床癥狀

發病哺乳仔豬體溫41.3～41.7℃，患豬渾身無力，顫抖，抽搐，站立不穩，精神沉郁，昏睡，嘔吐奶汁，呼吸急促、精神沉郁、不采食、排黃色水狀稀糞。眼瞼水腫，眼球外突，四肢呈游泳狀劃動，死亡時發出尖叫，牙關緊咬，角弓反張。

2.2 剖檢病變

剖檢2頭發病剛死亡哺乳仔豬，主要病變表現為肝臟呈土黃色；腎臟表面有大量針尖狀的紅色出血點，質地變脆；肺臟有散在的出血斑，輕微水腫；心臟冠狀脂肪上有針尖狀的出血點；腦膜充血明顯、腦脊液增多；扁桃體腫大、充血、喉頭黏膜充血、水腫。

2.3 病原學檢測結果

結合臨床癥狀和流行病學調查，實驗室檢測時針對病原做了相關檢測。乙腦病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒做了RT-PCR檢測，偽狂犬病病毒做了PCR檢測。檢測結果見表1，凝膠電泳如圖1。

表1 乙腦病毒和偽狂犬病病毒檢測

圖1 電泳檢測結果

2.4 序列分析

對JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）進行序列同源性分析，結果顯示，發病豬場感染的乙腦病毒屬于基因Ⅲ型，序列同源性為99%；眉山（ms）分離到的豬偽狂犬病gE全基因與參考株之間的相似性為98.3%～98.7%（圖2），表明眉山株gE基因的變異明顯。從圖3進化樹分析結果顯示，眉山株與福建分離株（福建株登錄號為FJ176390.1）距離最近。

圖2 眉山株與選取的參考株之間的遺傳距離

圖3 眉山株與參考株建立的遺傳進化樹

3 討論

豬偽狂犬病病毒和豬乙型腦炎病毒是導致豬繁殖障礙的兩種主要病原，并且兩種病毒均為多宿主病原。乙型腦炎作為人獸共患病受到很大的重視并積極預防；除了豬以外其他宿主感染偽狂犬病病毒后死亡率為100%。當前針對偽狂犬病雖然有基因缺失疫苗[9]，針對乙型腦炎有弱毒疫苗[10]，但是在養豬生產中這兩種疾病卻常有發生。本次案例發生時間為2015年7月，正值酷暑蚊蟲肆虐季節，為乙型腦炎的傳播提供了條件。

從臨床癥狀分析不難得出，兩種病原一起發病勢必會對仔豬造成快速的病理損傷。在剖檢病理觀察時，病變部位幾乎遍布大部分器官組織，并且多為急性出血、充血。總結分析以往多例偽狂犬病發病臨床癥狀，此次偽狂犬病極有可能存在很大的抗原表位漂移導致其組織嗜性發生變化，從而導致豬發病后所表現的臨床癥狀發生改變。

基因序列分析表明，本次獲得的乙型腦炎病毒基因序列在基因分型上屬于基因Ⅲ型，并未測毒力基因，所以不再做過多分析。本次獲得的偽狂犬病病毒gE基因序列從遺傳距離圖譜可以得出，其與從NCBI收錄的PRV gE序列的同源性在98.3%～98.7%之間，與福建分離株的同源性最高，從遺傳進化樹分析可以得出眉山株的變異情況明顯。

當前，規模化豬場雖然在疾病的防控和治療上都相對規范，但是各種病毒病和細菌病卻時有發生，多維多病原混合感染，加之豬只免疫力低下，因此，臨床上治療疾病的難度很大。豬場要貫徹“養重于防，防重于治，預防為主，養防結合”的方針，認真落實各項生物安全措施，防止病原侵入豬場。針對豬病要做到早發現、早診斷、早用藥、早治療；用藥對路、方法科學、方案可行，藥量足，療程夠的方針。堅持消毒制度，豬舍周圍要填平洼地，鏟除雜草，清理雜物，殺滅各種吸血昆蟲及鼠等，并用2%火堿水溶液進行消毒。養豬場要少用或不用抗生素，尤其是不要濫用或長期使用劣質的抗生素，因為這些藥物不僅對機體具有免疫抑制作用，影響疫苗的免疫效果，而且易產生耐藥性與藥物殘留，影響預防與治療疫病的效果，威脅公共衛生的安全。搞好免疫預防，提高豬群的特異性免疫力，制定合理的免疫程序，不要盲目接種疫苗，只有科學有效地管理豬場的日常生產生活才能使效益最大化。

[1]趙以云，王強，左瑞華.豬乙型腦炎的診斷與科學防治[J].畜牧與飼料科學，2009（Z1）：8-11.

[2]胡仲達.豬乙型腦炎病的診斷與防制[J].現代農業科技，2010（1）：329-330.

[3]曹俊衛.淺談豬乙型腦炎的防治措施[J].農民致富之友，2014（6）：233-234.

[4]高群，馮琦璞，王宇.豬乙型腦炎診斷技術[J].北京農業，2011（12）：92-93.

[5]陳葉，付新亮，粟碩，等.豬偽狂犬的防控策略和凈化[J].廣東飼料，2014（6）：46-48.

[6]景廣宇.豬偽狂犬的診斷方法及防治措施[J].畜禽業，2014（11）：78-80.

[7]朱秀高.豬場病原檢驗方法的應用分析與建議[J].廣東畜牧獸醫科技，2013（2）：14-17.

[8]袁磊.四川地區乙型腦炎病毒的分子流行病學調查研究[D].雅安：四川農業大學，2012.

[9]劉濤，趙京媛，孫曉成.豬偽狂犬疫苗研究進展[J].獸醫導刊，2012（12）：72-74.

[10]巢偉，張桂紅，徐雷.豬乙型腦炎病毒SA14-14-2疫苗株基礎種子的鑒定[J].中國獸藥雜志，2014（7）：15-18.

（編輯：富春妮）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0108-03

2015-11-23

長江學者發展計劃（IRT13083）

趙軍（1991-），男，四川瀘州人，在讀碩士研究生，研究方向為動物傳染病病原分子生物學.E-mail：zhaojun＠126.com

朱玲，教授，博士.E-mail：abtczl72＠126.com