新型納米銀殼聚糖敷料的應用研究*

趙大川，黃宗海，林志群，郎 敏，柳學文

(南方醫科大學珠江醫院普外科，廣州 510280)

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·技術與方法·

新型納米銀殼聚糖敷料的應用研究*

趙大川，黃宗?！?，林志群，郎 敏，柳學文

(南方醫科大學珠江醫院普外科，廣州 510280)

目的 觀察并評價新型納米銀殼聚糖敷料的物理特性、細胞毒性、抑菌性及其對傷口愈合的影響。方法 將納米銀材料添加到殼聚糖中制備新型復合生物抗菌敷料，并通過使用電子顯微鏡、CCK-8、抑菌圈及平板抑菌法、大鼠創傷動物模型愈合試驗將殼聚糖敷料、納米銀殼聚糖敷料、銀離子敷料及普通紗布敷料進行對比，以評價新型納米銀殼聚糖敷料的物理特性、細胞毒性、抑菌性及對傷口愈合的影響。結果 電子顯微鏡提示納米銀顆粒在殼聚糖敷料表面均勻分散，粒子直徑約50nm；抑菌圈及平板抑菌法提示新型納米銀殼聚糖敷料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞桿菌均有較強的抑菌能力；CCK-8實驗提示其在0.5%及1.0%的納米銀濃度下無明顯細胞毒性；動物愈合實驗提示納米銀殼聚糖敷料可以促進傷口愈合。 結論 納米銀殼聚糖敷料符合現代新型生物敷料的基本要求，相較傳統敷料有其優越性。

殼聚糖；納米銀；新型生物敷料；抗菌性

傷口愈合是一個復雜且精細的過程，是一系列不同類型細胞、蛋白激酶和生長因子等交互作用的結果，它們彼此之間相互協調，共同完成傷口修復[1]。1963 年Winter提出的濕性傷口愈合理論，發現保持傷口濕潤，避免形成結痂可以促進傷口恢復，濕潤的環境可以通過增加上皮再生，提高巨噬細胞及纖維母細胞活性，保持傷口清潔，減輕疼痛及減少敷料更換等方面促進傷口愈合[2-3]。為達到濕性愈合的效果，多種新興材料制成的敷料孕育而生。其中，殼聚糖材料因其具有生物相容性、生物可降解性、無毒性及免疫原性，已經在生物領域有較為廣泛的研究，且已經應用于血管支架、創傷修復等組織工程領域。在傷口修復領域，殼聚糖止血封堵敷料、殼聚糖創傷敷料已在我國批準使用[4]。

無機金屬銀具有抗菌譜廣、抗菌性能強及不易產生抗藥性等優點，近些年出現的含有納米銀的新型抗菌敷料在抗菌性及安全性上較以前的銀離子敷料又有了進一步發展，而既往的研究也曾嘗試將殼聚糖與納米銀結合，以制作一種具有更強抗菌性、生物相容性的材料[5-6]；或將殼聚糖與納米銀整合到常規敷料中[7-8]，使其可以在臨床中進行使用。本課題組嘗試制作基于普通殼聚糖敷料的新型納米銀殼聚糖(silver nanoparticles chitosan,SNC)敷料。并通過對其物理特性、細胞毒性、抗菌性及在實驗動物中的應用，來評價該新型復合生物抗菌敷料的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 動物： Wistar大鼠，體質量約250 g(由南方醫科大學實驗動物中心提供)。細胞：L-929(小鼠成纖維細胞)取自南方醫科大學細胞生物學研究所細胞庫。試劑：CCK-8試劑盒(日本同仁公司)。殼聚糖敷料：由濕法工藝將殼聚糖溶解后配制成一定濃度的紡絲原液，通過過濾、脫泡、凝固、拉伸、干燥等操作制成殼聚糖纖維，并用水刺法加工生產出醫用殼聚糖敷料。銀離子抗菌敷料購自百合公司(廣東)。納米銀溶液購自耐爾納米技術有限公司(張家港)。菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)及銅綠假單胞菌(ATCC27853)由南方醫科大學珠江醫院微生物實驗室提供并常規保存。儀器：NanoDrop 2000光譜儀(Thermo公司)；掃描電鏡 (Jeol 公司)；離子濺射儀(Jeol公司)；酶標儀(molecular devices，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SNC敷料的制備 采用自組裝技術制造SNC敷料，先將納米銀溶液用無菌去離子水稀釋，按照溶液與敷料質量比為50∶1的比例加入敷料所在容器中，使殼聚糖敷料浸入溶液中，溶液中所含納米銀質量分別為敷料質量的4.0%、2.0%、1.0%、0.5%，25 ℃在振蕩器中以80 r/min震蕩12 h。于65 ℃烘干敷料后分別用紫外照射敷料兩側各1 h。用分光光度計檢測反應前及反應后納米銀溶液光密度(OD)值，判斷納米銀離子是否與殼聚糖敷料組合。

1.2.2 SNC物理特性檢測 (1)紫外-可見分光檢測：用紫外-可見分光光度計(NanoDrop 2000)用于檢測SNC敷料，波長掃描范圍為200～800 nm。既往的研究提示417 nm處的紫外-可見光吸收峰是由于銀微粒表面的電子云周期性變化集體激發產生的表面等離子共振帶[8]，由此推斷納米銀是否已組合于殼聚糖敷料上。(2)殼聚糖敷料的掃描電鏡：將SNC敷料裁剪成面積為8 mm×8 mm，厚度為5 mm的小片，60 ℃干燥2 h后將樣品通過離子濺射鍍膜法進行導電處理，并進行觀察。

1.2.3 SNC敷料的細胞毒性實驗 基于用于醫療器械(ISO 10993-12和ISO 10993-5)生物評估的國際標準，估計敷料的細胞毒性。分別將不同濃度的已紫外消毒的SNC敷料0.5 g浸入50 mL 1640PRMI(加入10%胎牛血清)，并于37 ℃的條件下震蕩24 h。通過0.2 mm的過濾器將SNC敷料浸提液過濾以除去不溶物殘基，得到浸提液。選擇經美國食品、藥品監督管理局(FDA)認證的銀離子敷料，及未結合納米銀的殼聚糖敷料，按上述方法制備，分為未添加敷料浸提液的空白對照組、殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組，2.0%SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。將小鼠L-929 成纖維細胞以1×104/孔分別加入96孔板中培養，培養條件為37 ℃、體積分數為5%CO2的環境下用加入10%小牛血清的RPMI 1640培養液培養，培養24 h。之后，將培養基替換為先前獲得的浸提液(空白對照組更換為上述培養基)，按上述條件繼續培養24 h，移除培養基，按照CCK-8試劑盒說明書，將10 μL CCK-8及100 μL PRMI 1640試劑加入每個孔，并在37 ℃、5%CO2的環境下孵育30 min。由酶標儀在450 nm處檢測每個孔的吸光度。相對增殖率(%)=(樣品吸光度/空白對照組吸光度)×100%。根據相對增值率的大小，按表1評價不同敷料的細胞毒性。

表1 細胞毒性分級

1.2.4 SNC的抗菌性 (1)抑菌圈實驗：抑菌圈實驗可以模擬本敷料在潮濕或有滲出的傷口時敷料控制微生物增長的能力，作為具有較強吸濕能力的SNC敷料，有必要探尋其擴散抑菌能力。每種細菌分別以1×108/mL的濃度接種到營養瓊脂平板上，均勻涂抹3次，將不同濃度的SNC敷料、殼聚糖敷料及銀離子敷料分別剪裁成直徑為10 mm的圓形，濕潤后放入已經接種細菌的培養皿上，并在37 ℃、5%CO2的條件下孵育18 h時，并測量抑菌環的范圍。根據不同敷料的選擇，本實驗共分為殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組、2.0% SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。(2)震蕩法測定SNC敷料抑菌能力：將不同濃度的SNC敷料分別剪成1 cm×1 cm的大小，置于無菌離心管中，作為實驗組。選擇經FDA認證的銀離子敷料，及未結合納米銀的殼聚糖敷料，按上述方法制備，據置入敷料的不同，分為未添加敷料的空白對照組、殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組、2.0%SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。在每個離心管中加入4 mL 2XYT培養基。

分別在2XYT培養基中分別加入從瓊脂平板上挑取的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞桿菌菌落過夜培養后，將菌液濃度稀釋為(1.0～1.5)×105/mL的濃度，將1 mL菌液分別加入上述每個離心管中。將離心管在振蕩器中以25 ℃、200 r/min震蕩1 h，然后將其于37 ℃，5%CO2培養箱中繼續培養。分別于0、1、6和24 h，稀釋并涂布到瓊脂平板進行細菌數量測定。

1.2.5 傷口愈合實驗 將16只Wistar大鼠分為4組，即1%SNC敷料組、殼聚糖敷料組、銀離子敷料組和普通紗布敷料組。研究方案符合中國準則實驗動物。每只大鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉，除去背毛后皮膚用75%乙醇和安爾碘Ⅲ消毒。在每一只大鼠背后去毛處切除出一個面積為 100 mm2大小的完整厚度傷口。將敷料分別固定于每一只大鼠身上，每天在傷口處局部換藥。分別于第2、4、6、8、10天觀察實驗動物傷口愈合情況。創面愈合率=(術后傷口面積-第n天傷口面積)/術后傷口面積×100%。在術后第8天分別從各組取1只大鼠的皮膚樣品。將組織用10%福爾馬林溶液固定，并用乙醇梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，將組織切成5～7 mm寬的薄片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色。觀察上皮組織、皮脂腺、新生血管及肉芽組織情況。

2 結 果

2.1SNC敷料物理特性 紫外-可見吸收光譜見圖1，結果提示納米銀已組合于殼聚糖敷料上。SNC敷料的電鏡掃描結果見圖2，納米銀顆粒在殼聚糖敷料表面均勻分散，粒子直徑約50nm，但仍可見納米銀團聚現象。

圖1 SNC敷料的紫外-可見光譜

2.2SNC敷料的細胞毒性檢測L929細胞用上述6種浸提液及空白對照組處理24h后，殼聚糖無細胞毒性，而銀離子敷料具有中度細胞毒性，SNC敷料有一定細胞毒性，且其細胞毒性隨納米銀含量增加而增加，見圖3、表2。

2.3 抗菌性實驗

2.3.1 抑菌圈實驗 根據上述評價方法，發現單純的殼聚糖敷料在3種細菌中均無抑菌圈出現，而添加了納米銀的殼聚糖敷料，在3種不同細菌中，其抑菌圈大小隨著納米銀濃度的增加而逐步增加，見圖4。

圖2 SNC敷料的電鏡掃描圖

圖3 細胞毒性實驗

表2 不同敷料的細胞毒性評價

圖4 不同敷料分別在金葡菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌的抑菌圈

2.3.2 震蕩抑菌實驗結果 分別在1、6及24h測量添加不同敷料的各個離心管中細菌濃度，制作抑菌曲線，結果未添加納米銀的殼聚糖敷料無明顯抑菌性，而添加納米銀或具有銀離子的敷料則有較為優秀的抑菌性能，見圖5。

圖5 震蕩抑菌實驗抑菌曲線

2.4 傷口愈合實驗

2.4.1 傷口愈合程度測量 分別于第2、4、6、8、10天記錄傷口愈合情況。第6天時，1.0%SNC敷料組傷口愈合情況明顯優于其他組(P<0.05)，第10天時相較不具有抗菌能力的殼聚糖敷料組及普通紗布敷料組，1.0%SNC敷料組及銀離子敷料組的愈合率更高(P<0.05)，見表3、圖6。

表3 應用不同敷料小鼠傷口愈合情況

圖6 傷口愈合情況趨勢圖

2.4.2 組織染色 在切口愈合的第10天，HE染色顯示1.0%SNC敷料組中上皮組織增生良好，可見皮脂腺及新生血管，炎癥反應較輕；而普通紗布敷料組則顯示為不完全的上皮化形成，見圖7。

圖7 第10天不同組別小鼠傷口病理切片(HE，×20)

3 討 論

殼聚糖作為一種具有吸濕、抑菌、止血、調節炎癥反應的天然材料，是當前研究的熱點。然而殼聚糖的生物性能，又與多種因素相互關聯，不同的脫乙酰程度及相對分子質量的大小，會對其止血性、抗菌性及與炎癥反應產生極大影響。低脫乙酰度的殼聚糖甚至對耐甲氧西林金葡菌有很好的抑制性[9]，而小相對分子質量的殼聚糖也會提高組織對其降解的速度[10]。

既往的研究顯示，在一定范圍內，生物材料的抗菌性能與納米銀濃度呈正相關，為達到較為優秀的抗菌性能，一般需要納米銀的添加比例不低于生物材料的1.5%[11]，而在本實驗中，0.5%的SNC敷料已經顯示出優秀的抗菌能力，考慮其為納米銀與殼聚糖的協同作用所導致的抗菌性能提升。其協同作用表現為:(1)納米銀粒子尺寸小且比表面積大，容易與細菌發生接觸反應，使納米銀粒子黏附到細胞膜上，并滲入到細菌內部,在細菌細胞內部納米銀粒子通過與酶蛋白中的硫和磷發生作用，使細菌喪失酶活性，同時也會破壞細菌的呼吸鏈，導致細菌死亡[12]；(2)納米銀粒子在細菌細胞中可以釋放銀離子,從而進一步提高其抗菌能力；再次，殼聚糖上未反應的-NH2質子化生成-NH3+,能夠吸附細菌表面帶負電荷的分子基團而改變其細胞通透性,從而導致細菌細胞內組分如蛋白質與葡萄糖的泄露,致使細菌死亡；(3)殼聚糖復合物具有獨特的網狀結構,當與細菌接觸時,其更易堆積在細菌細胞表面而造成細胞代謝減弱,從而抑制細菌繁殖[13]。

現代生物敷料應該是具有良好保濕能力，不粘連新生肉芽組織，減少更換時患者的痛苦；可以促進上皮細胞再生，提高巨噬細胞及纖維母細胞活性；保持傷口清潔，減少傷口可能的細菌感染，促進傷口愈合的新型敷料。本課題組所制作的敷料，除了其優異的抗菌性外，低于1%的SNC模型更是無明細的細胞毒性。且在動物實驗中證明本敷料相較傳統敷料可以促進傷口的愈合，也能夠保持傷口的濕潤。綜上所述，本敷料符合現代生物敷料的要求。

但本實驗依然有一些問題尚待解決：(1)盡管選擇的納米銀材料是一種目前看來較為優秀的抗菌材料，相關的研究也證實在短期研究中，未見到銀對生物體產生嚴重不良反應[14-15]，但是其長期影響仍無定論。(2)現階段并未完全理解SNC敷料是如何影響傷口愈合的，其具體機制是為何。有研究提示小相對分子質量的殼聚糖可以抑制基質金屬蛋白酶2的活性及表達，當其相對應分子質量在(3～5)×103時，其可以達到最大的效應。而過量的基質金屬蛋白酶2被認為是抑制傷口愈合的因素之一。但這只是其中一個假設，關于SNC敷料如何促進傷口愈合，還需要進一步研究。

總而言之，SNC敷料符合現代新型生物敷料的基本要求，相較傳統敷料有其優越性，值得臨床進一步研究。

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Application research of a novel silver nanoparticles chitosan dressing*

ZhaoDachuan,HuangZonghai△,LinZhiqun,LangMin,LiuXuewen

(DepartmentofGeneralSurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510280,China)

Objective To evaluate the construction,cytotoxicity,antibacterial activity and wound healing application of a novel silver nanoparticles chitosan dressing.Methods Silver nanoparticles were added into chitosan to prepare a new compound biological antimicrobial dressing(silver nanoparticles chitosan dressing,SNC dressing).By using UV-Vis spectroscopy,scanning electron microscopy,CCK-8 test,zone of inhibition test,quantitative test and wound healing experiment,we evaluated the physical property of the new dressing and compared this new dressing with traditional dressing,chitosan dressing and silver ion-releasing chitosan dressing.Results UV-Vis Spectroscopy and SEM studies showed silver nanoparticles well dispersed in chitosan fiber with a particle size about 50 nm.In antimicrobial test,the SNC dressing showed a immense antimicrobial property for Staphylococcus aureus,escherichia coli and pseudomonas aeruginosa.In cytotoxicity test,the SNC dressing loading 0.5% and 1.0% silver nanoparticles was proved to behaved slight cytotoxicity.In wound healing experiments,healing promotion and improved reconstruction were observed in the SNC dressing compared with other dressings.Conclusion SNC dressing meets the basic requirements of the modern biological dressing and it might have more advantages comparing with traditional dressings.

chitosan;silver nanoparticles;novel biological dressings;antibacterial activity

廣州市海珠區科技計劃項目(2013-cg-27)。 作者簡介：趙大川(1990-)，在讀博士，主要從事外科敷料對傷口愈合方面研究。△

E-mail:drhuangzh@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.024

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A

1671-8348(2016)23-3237-04

2016-04-09

2016-06-29)