維吾爾族宮頸病變中VEGF-C與HPV相關性研究*

王新玲，李昭昭，古扎麗努爾·阿不力孜，夏 鳴

(1.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦外四科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦外五科，烏魯木齊 830011;3.重慶醫科大學第一臨床學院，重慶400046)

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·論 著·

維吾爾族宮頸病變中VEGF-C與HPV相關性研究*

王新玲1，李昭昭1，古扎麗努爾·阿不力孜2△，夏 鳴3

(1.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦外四科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦外五科，烏魯木齊 830011;3.重慶醫科大學第一臨床學院，重慶400046)

目的 探討血管內皮生長因子C(VEGF-C)在維吾爾族宮頸病變[宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅲ及早期宮頸癌]組織中的表達及其與人乳頭瘤病毒(HPV)載量相關性。方法 采用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)法測定140例維吾爾族婦女(慢性宮頸炎30例，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例,早期宮頸癌50例)宮頸石蠟切片組織中VEGF-C的水平；術前用第2代雜交捕獲(HC-Ⅱ)方法測定同一患者術前宮頸HPV載量；比較2個指標同宮頸病變的關聯。結果CINⅡ、CINⅢ及早期宮頸癌組織VEGF-C水平、宮頸病變程度及HPV載量均高于慢性宮頸炎組織(P<0.05)；組織中VEGF-C水平與HPV載量呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 新疆維吾爾族婦女宮頸組織中VEGF-C水平、HPV載量均與宮頸病變嚴重程度相關，且二者存在協同作用。

宮頸腫瘤；宮頸疾病；血管內皮生長因子；人乳頭瘤病毒

宮頸癌在女性惡性腫瘤中發病率排第4位[1]，是維吾爾族婦女高發的惡性腫瘤，總生存率排第7位[2-3]。據報道，宮頸癌發病人數約有50萬/年，死亡人數將近3萬/年。在中國，新疆是宮頸癌高發的地區。目前已經確定人乳頭瘤病毒 (human pappilomavirus,HPV)的持續感染是宮頸癌前病變發生及進展為宮頸癌的病因，但并不是全部HPV持續感染的女性都會罹患宮頸癌，這表明在宮頸癌發病過程中尚存其他協同因素[4-5]。本研究通過采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和HPV DNA第2代雜交捕獲((hybrid captureⅡ,HC-Ⅱ)法分別檢測140例維吾爾族宮頸病變患者組織中血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)的RNA表達水平及HPV病毒載量，以明確VEGF-C在新疆維吾爾族婦女宮頸病變發生、發展中的作用，及VEGF-C的RNA表達水平與HPV載量的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年12月到2015年6月符合納入標準的新疆醫科大學附屬腫瘤醫院住院患者的病理標本。石蠟標本：慢性宮頸炎30例(作為正常對照組)、宮頸上皮內瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia CIN) Ⅰ20例、CINⅡ 20例、CINⅢ20例、早期宮頸癌 50例并取同一患者治療前的宮頸HPV(定量)標本。標本納入標準：(1)所有患者均為維吾爾族婦女；(2)慢性宮頸炎標本均為子宮肌瘤行全子宮切除術后標本，均未合并任何宮頸疾病或其他影響試驗結果的疾病；(3)CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ均為初治錐切大體標本；(4)早期宮頸癌FIGO 2009分期ⅠB1～ⅡA1期均為鱗癌術后大體標本，術前未經過輔助放化療。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 RNAprep Pure FFPE Kit(DP439，天根，北京)；FastQuant RT Kit (KR106-02，天根，北京)；SYBR Select Master Mix (4472920，ABI，USA);梯度PCR儀(MyCycler Thermal Cycler,Bio-Rad,USA);Real-time PCR 儀器 (7500,ABI,USA)。

表1 宮頸病變與HPV載量相關性分析[n(%)]

1.2.2 總RNA抽提和cDNA合成 石蠟樣品切成5～10 μm厚的片狀，取出2～8張切片放置于1.5 mL RNase-Free離心管中，向離心管中加入1.0 mL二甲苯劇烈渦旋10 s，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心2 min。加入1.0 mL無水乙醇渦旋混勻，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心2 min。37 ℃放置10 min。加入200 μL裂解液RF，10 μL Proteinase K徹底渦旋混勻55 ℃孵育15 min，80 ℃孵育15 min，室溫15～25 ℃，12 000 r/min離心5 min。加入220 μL的緩沖液RB，660 μL的無水乙醇，12 000 r/min 離心1 min。加入80 μL的DNase Ⅰ工作液，室溫15 min。加入500 μL去蛋白液RW1，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心30～60 s。加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心30～60 s；室溫15～25 ℃，12 000 r/min離心2 min。懸空滴加30～100 μL RNase-Free雙蒸水(ddH2O)，室溫12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度、A260/A280，電泳檢測RNA完整性。RNA樣本按照5×g DNA Buffer 2 μL、Total RNA、RNase-Free ddH2O補足到 10 μL配置好體系簡短離心(42 ℃，孵育3 min)。 將反轉錄反應中的Mix(10×Frist-Strand Buffer 2 μL，RT Primer Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O補足到 10 μL)加入反應液混勻(42 ℃，15 min；95 ℃，孵育3 min)，得到的cDNA。

1.2.3 Real-time PCR檢測 引物由歐易生物公司設計合成，反應體系：Forward primer (10 μmol/L)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 0.4 μL，SYBRR Select Master Mix (2X) 10.0 μL，cDNA template 1.0 μL，RNase-Free water加至20.0 μL。上游引物：5′-GGC TGG CAA CAT AAC AGA GAA-3′，引物長度21 bp，下游引物： 5′-CCC CAC ATC TAT ACA CAC CTC C-3′， 引物長度22 bp。每個樣品重復3次實驗，通過觀察樣品擴增曲線和熔解曲線，了解實驗情況。同時進行內參基因β-Actin檢測。將標準品進行l0倍梯度稀釋拷貝5個梯度后，進行Real-time PCR，將陽性梯度的模板濃度和對應的CT值進行標準曲線的計算，相對表達量=2-ΔΔCt。

1.2.4 高危型HPV的檢測 手術前采用HC-Ⅱ法檢測患者宮頸HPV載量。用專用HPV取樣器,插入宮頸外口,順/逆時針(同方向)轉動5～8圈,取出后放入含有保存液的配套試管中，隨后送至該院檢驗科進行檢測。HPV試劑購于上海凱杰企業管理有限公司(Qiagen Gaithersburg,MD20878,Inc)。HC-Ⅱ檢測樣本中HPV-DNA水平。具體操作步驟由檢驗科的檢驗專業醫師操作，按試劑盒說明的詳細步驟進行檢測。

2 結 果

2.1VEGF-C的表達 各組組織中VEGF-C基因的相對表達量不同，其中CINⅡ[(1.158±0.144)pg/mL]、CINⅢ[(2.161±0.288)pg/mL]及早期宮頸癌[(2.929±0.600)pg/mL]組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎[(1.009±0.135)pg/mL]組織明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；CINⅢ及早期宮頸癌組織中VEGF-C水平比CINⅠ[(1.071±0.124)pg/mL]、CINⅡ均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；早期宮頸癌組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ組織均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2HPV的感染情況HPV在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ和早期宮頸癌中的感染情況(HPV載量大于1為感染)分別為 3/30(10%)、16/20(80%)、17/20(85%)、19/20(95%)和50/50(100%)，病變程度越高，HPV感染率亦明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1；HPV載量同宮頸病變程度有相關性，呈中度正相關(r=0.59，P<0.01)。

2.3VEGF-C和HPV載量的關系 經Spersman等級相關分析,VEGF-C在宮頸病變的表達水平與HPV載量有相關性，呈正相關(r=0.179，P=0.035)。

3 討 論

3.1VEGF-C與宮頸病變的關系VEGF在目前已知的各種淋巴管內皮生長刺激因子中特異性最高，其中VEGF-C最為顯著。VEGF-C是目前公認的淋巴管生成因子，可以導致淋巴管內皮細胞增殖、分化、遷移，在誘導腫瘤細胞的增殖及轉移過程中起重要作用。有研究表明,VEGF-C在正常宮頸組織中不表達，在CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中表達均增高[6]。Inamine等[7]研究證明，VEGF-C是宮頸癌變的早期標志物，并與CIN級別呈正相關。也有研究證明，VEGF-C可促進腫瘤直徑增大、原發腫瘤進展，從而導致局部浸潤、淋巴結遠處轉移，最終可在一定程度上影響腫瘤預后[8-10]。本研究結果顯示，高級別宮頸病變(CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌)組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎組織明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ和宮頸癌發展過程中水平逐漸增高,在宮頸癌中最高，差異有統計學意義(P<0.05)。說明VEGF-C與維吾爾族宮頸癌發生、發展密切相關，可能在CIN發展為宮頸癌并繼續進展轉移過程中發揮一定作用，本研究與其他研究結果相符。

3.2HPV載量與宮頸病變的關系HPV主要侵犯皮膚和黏膜的上皮細胞。HPVE基因編碼的蛋白具有多種調控功能，E6、E7是最重要的調控蛋白，可促使腫瘤發生、發展。研究已經確定，高危型HPV病毒的持續感染可以導致宮頸癌前病變發生并最終發展為宮頸癌。呂倩靈等[11]認為宮頸癌及其癌前病變的發生、發展與高危型HPV的感染及其病毒載量高低密切相關。高玉華等[12]針對各級別宮頸病變中HPV病毒載量的分布研究發現，HPV病毒載量與宮頸病變的嚴重程度具有密切相關性，HPV病毒較高載量的持續感染預示著宮頸高級別病變發生率增高。本研究的結果表明，維吾爾族各級別宮頸病變與慢性宮頸炎組織相比，HPV感染率明顯升高，且宮頸HPV感染率與宮頸上皮細胞損傷嚴重程度呈正比，差異有統計學意義(r=0.59，P<0.01)。

3.3VEGF-C和HPV的關系HPV致癌機制尚不完全明確，目前關于HPV載量和VEGF-C相關性的研究尚不多見。Huang等[13]通過PCR的方法將HPV-16E6陽性的細胞同HPV-16E6陰性的比較，發現HPV的原癌基因可能通過直接作用于VEGF-C的基因啟動子區促進腫瘤血管生成，提示VEGF-C的表達與HPV密切相關。還有研究進一步發現HPV-16E6原癌蛋白可以激活缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)，增強了VEGF-C的釋放，同時，HPV-16E5的原癌蛋白還通過激活多條信號通路上調了VEGF-C的表達[14-16]。目前試驗結果表明，HPV、VEGF-C在細胞周期調控之間可能存在著極其復雜的網絡化的相互聯系，二者在宮頸癌前病變及宮頸癌的發生、發展及腫瘤血管生成過程中發揮協同作用，因此認為HPV的免疫表達同VEGF-C的密度顯著相關，HPV感染可能刺激了宮頸癌中腫瘤血管生成，這是HPV引發宮頸癌的重要機制之一。本研究結果顯示，維吾爾族婦女各級別宮頸病變組織中VEGF-C表達水平和高危HPV載量呈正相關(r=0.18，P<0.01)，提示二者之間存在一定的內在聯系，但相關性較弱。考慮可能為本研究樣本量較小，需前瞻性大樣本試驗進一步證實維吾爾族患者HPV是否通過提高VEGF-C水平而導致惡性腫瘤發生、發展及播散。還有研究進一步發現HPV-16E6原癌蛋白可以激活HIF-1α，增強了VEGF-C的釋放，同時，HPV-16E5的原癌蛋白還通過激活多條信號通路上調了VEGF-C的表達[12-14]。因此有理由認為HPV的免疫表達同VEGF-C的水平顯著相關，HPV感染可能刺激了宮頸癌中腫瘤血管生成，這是HPV引發宮頸癌的重要機制之一。目前試驗結果表明，HPV、VEGF-C在細胞周期調控之間可能存在著極其復雜的網絡化的相互聯系，二者在宮頸癌前病變及宮頸癌的發生、發展及腫瘤血管生成過程中發揮協同作用。

高危型HPV的感染可促進VEGF-C表達增加，進一步引起宮頸癌組織的血管生成，是宮頸癌發生、侵襲及轉移的重要機制之一。但目前高危型HPV感染如何促進血管內皮生長因子C在腫瘤血管及淋巴管形成中的作用和具體機制尚不完全明確，需要進一步的研究，若明確其作用，則可以通過阻斷該途經，從而防止CIN向宮頸癌發展。

[1]ParkJY,SheungNganHY,ParkW,etal.AsianSocietyofGynecologicOncologyInternationalWorkshop2014[J].JGynecolOncol，2014,26(1):68-74.

[2]RebeccaS,JieminM,ZouZH,etal.Cancerstatistics,2014[J].CA,2014,64(1):9-29.

[3]FerlayJ,SoerjomataramI,DikshitR,etal.Cancerincidenceandmortalityworldwide:sources,methodsandmajorpatternsinGLOBOCAN2012[J].IntJCancer,2015,136(5):359-386.

[4]SnijdersPJ,VerhoefVM,ArbynM,etal.High-riskHPVtestingonself-sampledversusclinician-collectedspecimens:areviewontheclinicalaccuracyandimpactonpopulationattendanceincervicalcancerscreening[J].IntJCancer,2013,132(10):2223-2236.

[5]WentzensenN,SchiffmanM,PalmerT,etal.TriageofHPVpositivewomenincervicalcancerscreening[J].JClinVirol,2015,14(2):107-109.

[6]王惠芬,毛熙光.腫瘤增殖相關分子(TSPAN-1)和血管內皮生長因子C(VEGF-C)在宮頸鱗癌中的表達及意義[J].當代醫學,2016,15(6):1-4.

[7]InamineM,NagaiY,MitsuhashiA,etal.CigarettesmokestimulatesVEGF-Cexpressionincervicalintraepithelialneoplasia(CIN) 1and2lesions[J].IntJClinOncol,2012,17(5):498-504.

[8]DuanL,YeL,ZhaoG,etal.Serumspleentyrosinekinaseandvascularendothelialgrowthfactor-Clevelspredictlymphnodemetastasisofoesophagealsquamouscellcarcinoma[J].EurJCardiothoracSurg,2013,43(3):58-63.

[9]WakisakaN,HirotaK,KondoS,etal.Inductionoflymphangiogenesisthroughvascularendothelialgrowthfactor-C/vascularendothelialgrowthfactorreceptor3axisanditscorrelationwithlymphnodemetastasisinnasopharyngealcarcinoma[J].OralOncol,2012,48(8):703-708.

[10]AcsG,ParaghG,RakosyZ,etal.TheextentofretractioncleftscorrelateswithlymphaticvesseldensityandVEGF-Cexpressionandpredictsnodalmetastasisandpoorprognosisinearly-stagebreastcarcinoma[J].ModPathol,2012,25(2):163-177.

[11]呂倩靈,張玲,林偉平,等.高危型人乳頭狀瘤病毒及病毒載量對宮頸癌癌前病變的相關性分析[J].中華醫院感染學雜志,2014,24(4):804-805.

[12] 高玉華,高巖,湯巍巍,等.高危型HPVDNA檢測在宮頸病變診治中意義的研究[J].中國婦幼保健,2010,25(11):1548-1550.

[13]HuangQ,QuQX,XieF,etal.CD40isoverexpressedbyHPV16/18-E6positivecervicalcarcinomaandcorrelatedwithclinicalparametersandvasculardensity[J].CancerEpidemiol,2011,35(4):388-392.

[14]Toussaint-SmithE,DonnerDB,RomanA.Expressionofhumanskinkeratinocytesissufficienttoaltertheexpressionofangiogenicfactors[J].Oncogene,2004,23(17):2988-2995.

[15]ChenL,WuYY,LiuP,etal.Down-regulationofHPV18E6,E7orVEGFexpressionattenuatesmalignantbiologicalbehaviorofhumancervicalcancercells[J].MedOncol,2011,28(1):528-539.

[16]ZappacostaR,LattanzioG,ViolaP,etal.AveryrarecaseofHPV-53-relatedcervicalcancer,ina79-year-oldwomanwithaprevioushistoryofnegativepapcytology[J].ClinIntervAging,2014,9(2):683-688.

Correlation between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease of Vighur population*

WangXinling1,LiZhaozhao1,Guzalnur·Abuliz2△，XiaMing3

(1.4thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;2.5thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;3.theFirstClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400046，China)

Objective To study the relations between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease in Uighur population of Xinjiang.Methods A total of 140 cases including 30 cases of normal cervical tissues,60 cases of CINⅠ-Ⅲ and 50 cases of cervical cancer tissues were selected in this experiment.The expression of VEGF-C of all cases were detected by Real-time PCR assay;HPV load were detected by HC-Ⅱ before operation.And we compared the relationship between cervical lesions and these two index.Results VEGF-C and HPV load were both over-expressed in cervical cancer and CINⅡ-Ⅲ tissues,compared with normal cervical tissues(P<0.05).In cervical cancer samples and CIN samples,the expression level of VEGF-C and the degree of cervical diseases were positive associated with HPV load(P<0.05).Conclusion The expression level of VEGF-C and HPV load are both related to the degree of cervical lesions.

uterine cervical neoplasms；uterine cervical diseases；vascular endothelial growth factor；human pappilomavirus

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.002

新疆維吾爾自治區自然基金(2013211A071)。作者簡介：王新玲(1966-)，主任醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面研究。△

Email：gzlnr@qq.com。

R

A

1671-8348(2016)23-3173-03

2016-04-15

2016-06-30)

*qq.com。