復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠血清ADMA水平及胸主動脈eNOS、NF-κB表達的影響

邊 云 田風勝 張 倩 石 驍 劉瑞雪

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復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠血清ADMA水平及胸主動脈eNOS、NF-κB表達的影響

邊 云 田風勝*張 倩 石 驍 劉瑞雪

目的：觀察復榮通脈膠囊對糖尿病(DM)大鼠血清非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、核轉錄因子-κB(NF-κB)表達水平的影響，進一步探討其防治DM大血管病變的作用機制。方法：60只Wistar大鼠先分為空白對照組(n=10)和造模組(n=50)，后者復制DM模型后，再分為DM組(n=9)、復榮通脈低劑量組(n=10)、復榮通脈中劑量組(n=9)和復榮通脈高劑量組(n=9)，低、中、高劑量組分別給予0.7、1.4、2.8g/kg體重復榮通脈膠囊灌胃，其余兩組給予等量純凈水灌胃。8周后，從胸主動脈采血檢測ADMA水平；留取胸主動脈制備病理切片，SP法免疫組化染色觀察胸主動脈eNOS和NF-κB陽性染色面積及強度。結果：與空白對照組比較，DM組及復榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA水平及組織NF-κB表達明顯增加(P<0.01),組織eNOS表達明顯降低(P<0.01)；與DM組比較，復榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA水平及組織NF-κB表達明顯降低(P<0.01)，組織eNOS表達明顯升高(P<0.01)；中、高劑量組ADMA、NF-κB的降低和eNOS的升高更明顯(P<0.05)。結論：復榮通脈膠囊通過降低DM大鼠血清ADMA水平，上調胸主動脈eNOS和下調NF-κB的表達，對大血管病變發揮保護作用。

復榮通脈膠囊；糖尿病大鼠；非對稱性二甲基精氨酸；內皮型一氧化氮合酶；核轉錄因子-κB

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由胰島素分泌不足或功能缺陷引起的，以慢性高血糖為主、合并脂肪和蛋白質代謝紊亂為特征的臨床綜合征。DM血管病變作為DM慢性并發癥之一，是DM致殘致死的最主要原因。DM大血管病變的病理基礎為動脈粥樣硬化(Arteriosclerosis，AS)，而內皮細胞受損和內皮依賴性血管舒張功能障礙啟動AS，并貫穿于AS發生發展的整個過程中。復榮通脈膠囊是與本院自制中藥制成的復方制劑(冀藥制字Z20070041)，具有益氣養陰、活血通絡功效，開發之初主要用于治療DM性周圍血管病變及周圍神經病變，之后發現其對DM大血管病變亦療效顯著，且能預防血栓形成。但其作用機制不甚明了。本研究通過DM大鼠模型觀察復榮通脈膠囊對其血清非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平和胸主動脈內皮型一氧化合酶(eNOS)和核轉錄因子-κB(NF-κB)表達的影響，探討其保護內皮細胞和內皮依賴性血管舒張功能，從而防治大血管病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重 200g±30g)60 只，由河北醫科大學實驗動物中心提供[動物合格證號：1405034，單位許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。分籠(每籠4只)飼養，自由飲水，室溫22℃-26℃。濕度45%-65%，每日12h光照維持，晝夜循環。

1.1.2 實驗藥物：復榮通脈膠囊，主要由水蛭、地龍、全蝎、黃芪、當歸、玄參、葛根、穿山龍、首烏藤、川牛膝、甘草等組成，由河北省滄州中西醫結合醫院中藥制劑室監制生產，每粒0.5g，批準文號：冀藥制字Z20070041，生產批號：140310。實驗時按比例加入純凈水制成混懸液。

1.1.3 實驗試劑和儀器：鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸鈉為美國sigma公司產品；ADMA ELISA試劑盒，eNOS、NF-κB免疫組化試劑盒由石家莊市淼森科技有限公司提供；德國羅氏公司血糖儀(羅康全活力型)；日本日立公司7600-010型全自動生化分析儀；日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11光學顯微鏡及其照相裝置；病理組織漂烘處理儀；病理圖文分析系統；日本HM-200電子天平和德國Eppendorf-5430離心機；德國萊卡RM2015石蠟切片機；日本三洋MDF-382E型超低溫冰箱和江蘇太倉醫用儀器廠DSHZ-300型恒溫水浴箱；美國Media Cybernetics 公司多功能真彩色細胞圖像分析管理系統。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及復制DM模型：60只實驗Wistar大鼠，適應性喂養1周后，按照完全隨機原則分為空白對照組(n=10)和DM造模組(n=50)，造模組大鼠禁食12h后按文獻[1，2]方法(略作改進)，一次性腹腔注射1% STZ 60mg/kg(臨用前將STZ粉溶于0.1mmol/L、pH4.2無菌檸檬酸鈉緩沖液)；空白對照組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。72h后尾靜脈取血測血糖(BG)，BG≥16.7mmol/L確定為DM模型大鼠。本次造模有3只大鼠BG未達診斷標準，并死亡3只，共造模成功44只。平穩一周后進行下述實驗。

1.2.2 藥物干預：44只成模大鼠按照數據表法抽取40只平分DM組、復榮通脈低劑量組、復榮通脈中劑量組和復榮通脈高劑量組，每組10只。另4只用作其它實驗。參考文獻方法，按人體-大鼠體表面積比值表換算出實驗大鼠等效劑量[1]，每天新鮮配制藥液(準確稱取實驗所需藥粉溶于純凈水中)。復榮通脈中劑量組給予1.4g/kg體重灌胃、復榮通脈低劑量組給予0.7g/kg體重灌胃、復榮通脈高劑量組給予2.8g/kg體重灌胃，容積10ml/kg，每日一次，連續8周。空白對照組和DM組每日給予等量純凈水灌胃。期間大鼠自由進食標準飼料，自由飲水，每天更換墊料，清理實驗室。

1.2.3 BG和血清ADMA水平測定：連續灌胃8周后，各組大鼠隔夜禁食12h(飲水不限)，空腹稱重，以3%戊巴比妥鈉(80mg/kg)[2]腹腔注射麻醉，尾尖采血，用羅氏血糖儀檢測BG水平；之后，迅速常規方法開胸、分離胸主動脈，從胸主動脈采血2ml，按試劑盒說明書采用ELLSA檢測血清ADMA水平。

1.2.4 組織eNOS、NF-κB水平測定：分離各組大鼠胸主動脈1-2cm，置于4%多聚甲醛中固定，洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5μm)，采用免疫組化SP法染色，嚴格按照試劑盒說明書操作。應用彩色病理圖文分析系統計算病理組織切片中eNOS、NF-κB陽性染色面積與視窗面積的百分比(%)。細胞核和(或)細胞質出現棕黃色、棕褐色顆粒為陽性組織。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠存活情況及BG水平

復榮通脈治療8周后，DM組死亡1只(可能為腹部注射STZ繼發感染所致)；復榮通脈中劑量組死亡1只，可能死于酮癥酸中毒或高滲綜合征；復榮通脈高劑量組逃逸1只。治療前，DM組及復榮通脈低、中、高劑量組BG水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，且四組間無明顯差異(P>0.05)。治療8周后，DM組和復榮通脈低、中、高劑量組BG水平雖較治療前降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。DM組及復榮通脈低、中、高劑量組BG水平仍然明顯高于空白對照組(P<0.01)，但四組間仍無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后BG比較±s)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01

2.2 各組血清ADMA水平比較

治療8周后，與空白對照組比較，DM組血清ADMA水平明顯升高(P<0.05)；與DM組比較，復榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA降低，復榮通脈中、高劑量組血清 ADMA水平降低更明顯(P<0.05)，且中、高劑量組間差異無統計學意義(P>0.05)。 見表2 。

表2 各組大鼠治療8周后血清ADMA水平比較±s)

注：與空白對照組比較，1)P<0.05;與DM組比較，2)P<0.05；與復榮通脈低劑量組比較,3)P<0.05

2.3 各組胸主動脈eNOS表達水平比較

免疫組化染色結果顯示，胸主動脈內皮SP染色eNOS陽性細胞胞膜呈棕、黃色。空白對照組eNOS陽性染色面積較大，DM組顯著減少(P<0.01)，復榮通脈低、中、高劑量灌胃治療8周后胸主動脈eNOS陽性面積較DM組增加(P<0.01)；尤其中、高劑量治療組陽性面積更大于低劑量組(P<0.05)；且中、高劑量組間差異無統計學意義(P>0.05)，但仍小于空白對照組(P<0.05)。見圖1、表3。

2.4 各組胸主動脈NF-κB表達水平比較

免疫組化染色結果顯示，胸主動脈內膜SP染色NF-κB陽性細胞核呈棕、褐色。空白對照組NF-κB陽性面積較小，DM組面積較大(P<0.01)，復榮通脈低、中、高劑量灌胃治療8周后大鼠胸主動脈NF-κB陽性面積明顯較DM組明顯減少(P<0.01)，其中、高劑量組更少于低劑量組(P<0.05)；且中、高劑量組間無明顯差異(P>0.05)；但仍多于空白對照組(P<0.05)。見圖2、表3。

[本文圖1、圖2見封2]

3 討 論

有研究在4 845例DM患者中發現大血管病變率達38.3%[3]。AS是DM血管病變的病理基礎，貫穿血管病變始終。高血糖可加速AS進程，導致全身多處大血管受累，發生彌漫性管腔狹窄及多發不穩定斑塊，引起多種DM性心腦血管疾病，如冠心病、腦卒中及腎動脈硬化、下肢動脈硬化、壞疽等，是造成DM患者致殘和死亡的主要原因[4]。

表3 各組大鼠胸主動脈eNOS、NF-κB表達水平比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.01; 與DM組比較,2)P<0.01;與復榮通脈低劑量組比較,3)P<0.05

NO作為人體內的血管舒張因子，不僅能夠舒張血管、促進內皮細胞生長，還能抑制白細胞趨化、黏附和血小板聚集，同時抑制平滑肌細胞增殖[5]，具有抗AS作用。高血糖誘導氧化應激觸發的線粒體呼吸鏈傳遞效應以及血管內皮細胞來原ADMA均可使體內反應性氧產物(Reactive Oxygen Species,ROS)增多[6,7]，引起eNOS表達下調及NO的生物利用度降低，進而導致內皮功能障礙[8，9]。ADMA是L-精氨酸類似物，具有競爭性抑制eNOS活性部位和降低eNOS活性、調節NO合成的作用[10]。而且，體內ADMA水平升高導致NOS失偶聯產生的過多自由基又會使ADMA進一步升高，從而損傷血管內皮，造成血管病變[11]。NF-κB是細胞內普遍存在的二聚體核轉錄因子，主要參與包括免疫和炎性細胞的基因轉錄，調節多種參與及加速AS基因的表達，包括細胞因子、細胞間黏附分子(ICAM-1)、血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)、NOS、血管緊張素II(AngII)等，在DM血管病變中發揮作用。徐雪晶等[12，13]的實驗發現，ADMA也可能通過以下NF-κB途徑介導AS：(1)增強氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)表達，促使巨噬細胞轉化為泡沫細胞；(2)升高iNOS的表達水平，促進巨噬細胞轉化為泡沫細胞。從而不斷加速DM血管病變的發生發展。

本研究中，DM大鼠胸主動脈ADMA水平及NF-κB表達明顯升高，eNOS表達明顯降低，表明ADMA、NF-κB、eNOS在DM大血管并發癥中起重要作用。不同劑量復榮通脈膠囊均可降低血清ADMA水平，同時抑制NF-κB、促進eNOS在大鼠胸主動脈的表達，尤以中、高劑量組效果更好，且中、高劑量組間無差異。提示復榮通脈膠囊可改善血管內皮功能紊亂，對DM大血管病變具有一定治療作用，推薦臨床使用以中劑量為宜。

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本文第一作者簡介：

邊 云(1987-)，女，漢族，碩士，住院醫師，主要從事糖尿病的中西醫結合臨床研究

1 徐淑云,卞如濂, 陳 修. 藥理實驗方法[M].北京：人民衛生出版社, 2005：202-204.

2 徐淑云,卞如濂,陳 修,藥理實驗方法[M].北京：人民衛生出版社, 2005:1 846-1 849.

3 王玉珍, 趙德明, 許樟榮, 等. 糖尿病合并大血管病變的危險性研究4845例糖尿病患者合并慢性并發癥及治療現狀調查[J]. 中國糖尿病雜志, 2006, 14(3):197-200.

4 衛生部疾病控制司，中華醫學會糖尿病分會.中國糖尿病防治指南(試行本)[J]. 中國慢性病預防與控制, 2004, 12(6):283-285.

5 Cuerci B, Behme P, Kearney Schwartz A, et al. Endothelial dysfunctio and type 2 diabetes. Part2:altered endothelial function and the effects of treatments in type 2 diabetes mellitus[J]. Diabetes Metab, 2001,27(1):436-447.

6 張成鐵, 葛志明, 楊純珍. 2型糖尿病心血管病變與一氧化氮及一氧化氮合酶的關系[J]. 中國老年學雜志, 2006, 26(7):1 010-1 012.

7 Haidara MA. Yassin HZ, Rateb M, et al. Role of oxidative stress in development of cardiovascular complications in diabetes mellitus[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2006, 4(3):215-227.

8 Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, et al. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J]. Nature, 2000, 404(6 779):787-790.

9 Aqo T, Kitazono T, Ooboshi H, et al. Nox4 as the major catalytic component of an endotheial NAPDH oxidase[J]. Circulation, 2004, 109(2):227-233.

10 Sasaki S, Inoguchi T. The role of oxidative stress in the pathogenesis of diabetic vascular complications[J]. Diabetes Metab J, 2012, 36(4):255-261.

11 Boger RH, Bode-Boger SM, SzubaA,et al. Asymmetric dimethy larginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction:its role in hypercholesterolemia[J]. Circulation, 1998, 98(18):1 842-1 847.

12 Cooke JP. Dose ADMA cause endothelial dystunction[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(9):2 032-2 037.

13 徐雪晶, 何 軍, 張新金, 等. NF-κB介導ADMA上調大鼠腹腔巨噬細胞LOX-1的表達[J]. 華中科技大學學報(醫學版), 2010, 39(6):771-774.

14 徐雪晶, 何 軍, 張新金, 等. 核因子-κB介導非對稱性二甲基精氨酸上調大鼠腹腔巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶的表達[J]. 臨床心血管病雜志,2010, 26(10):780-783.

Influence of Furongtongmai Capsule on the Expression of eNOS and ADMA, NF-κB in Thoracic Aorta Tissue of Diabetic Rats

BIAN Yun, TIAN Feng-sheng*,ZHANG Qian,SHI Xiao,LIU Rui-xue

Department of Endocrinology,Affiliated CangZhou Traditional-western Combination Medical Hospital of Hebei Medical University, Cangzhou 061001，China;*Corresponding author

Objective: To observe the effect of traditional chinese medicine compound preparations -Furongtongmai capsule on the expression of eNOS, ADMA and NF-κB on thoracic aorta tissue of diabetic rats, and the protective effects of Furongtongmai capsule on the diabetes vascular lesions were examined in this study. Method: 60 Wistar rats were randomly divided into two groups: normal control group (NC,n=10), build modle group (n=50). After diabetes mellitus(DM) rats were made,40 of diabetes rats were randomly divided into DM group(n=9), Fu rong tong mai capsules low dosage group(FRL)(n=10), Fu rong tong mai capsules middle dosage group(FRM)(n=9), Fu rong tong mai capsules high dosage group(FRH)(n=9). FRM was given the 1.4 g/(kg body weight) to fill the stomach,FRL was given 0.7 g/kg body weight, FRH was given 2.8 g/(kg body weight) , the rest of the two groups of daily to give the same dose of purified water. 8 weeks later, 2 mL blood was taken from thoracic aortic for serum ADMA betection. The expression of eNOS and NF-κB on thoracic aortic tissue were examined with immunohistochemical staining.The positive area and integrated optical density (IOD) was measured by colour image analytic system. Results: Compared with NC group,DM group and FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS decreased(P<0.01). Compared with DM group, FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS increased(P<0.01). Compared with FRL group, FRM and FRH group expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.05)， eNOS increased(P<0.05).Conclusion: Furongtongmai capsule can reduce serum ADMA level. Beside it can inhibit the NF-κB and promote the expression of eNOS in thoracic aorta in rats.Furongtongmai capsule plays a protective role on blood vessels. So it has a certain therapeutic effect on diabetic vascular lesions.

Furongtongmai capsule; Diabetic rats; ADMA; eNOS; NF-κB

河北省滄州中西醫結合醫院內分泌三科，滄州 061001；*

本文2016-08-20收到，2016-09-31修回

R587.1；R285.5

A

1005-1740(2016)04-0011-04