LC-MS/MS法測定人尿液中他唑巴坦鈉濃度及其尿藥排泄動力學研究Δ

任立玲，王源園，孫魯寧，張宏文，謝利軍，劉　云，王永慶1，#（1.南京醫(yī)科大學藥學院，南京　1009；.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南京　1009）

·臨床藥學與研究·

LC-MS/MS法測定人尿液中他唑巴坦鈉濃度及其尿藥排泄動力學研究Δ

任立玲1＊，王源園2，孫魯寧2，張宏文2，謝利軍2，劉云2，王永慶1，2#（1.南京醫(yī)科大學藥學院，南京210029；2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南京210029）

目的：建立測定人尿液中他唑巴坦鈉濃度的方法，并進行尿藥排泄動力學研究。方法：尿液樣品經10%高氯酸沉淀后，采用高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定尿液中他唑巴坦鈉的濃度。色譜柱為Hypersil GOLD C18，流動相為甲醇-水（30∶70，V/V），流速為0.2 ml/min，柱溫為30℃，進樣量為5 μl；采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測方式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對為m/z 301→168。入組8名健康受試者，靜脈滴注注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1，m/m）2.34 g，收集其給藥前和給藥后0～2、2～5、5～8、8～12和12～16 h的尿液研究其尿液排泄動力學。結果：他唑巴坦鈉尿藥濃度在0.25～500 μg/ml范圍內線性關系良好（r＝0.999 9），定量下限為0.25 μg/ml，批內、批間RSD＜10%，方法回收率為93.8%～111.8%，提取回收率為93.9%～99.7%，介質效應為87.6%～107.2%。受試者用藥16 h后，他唑巴坦鈉的尿累積排泄量為（209.70±39.24）mg，累積排泄率為（61.7±11.5）%。結論：LC-MS/MS法用于人尿液中他唑巴坦鈉濃度的測定和排泄動力學的研究簡便、快捷、靈敏度高；他唑巴坦鈉主要經腎臟排瀉。

高相液相色譜-串聯質譜法；他唑巴坦鈉；尿液；尿藥濃度；排泄動力學

頭孢噻肟鈉是第三代頭孢菌素類抗菌藥物，通過破壞細菌細胞壁的合成來發(fā)揮廣譜抗菌作用，對革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌均具有較強的抗菌活性。隨著臨床使用越來越廣泛，其耐藥率逐年遞增[1]。他唑巴坦鈉是舒巴坦的衍生物，為不可逆的β-內酰胺酶競爭性抑制劑。兩者組成的復方制劑可增強頭孢菌素類抗菌藥物對β-內酰胺酶的穩(wěn)定性，擴大抗菌譜范圍，從而避免或減少耐藥性的發(fā)生，可用于各種敏感菌、多重耐藥菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、銅綠假單胞菌、產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌引起的感染[2]。不同配比的頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉的殺菌作用明顯強于頭孢噻肟鈉單藥。前期體外抗菌研究表明，頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉具有較強的體外抗菌作用，綜合考慮藥物療效和不良反應、生產和使用成本等多方面因素，6∶1（m/m，下同）為較合理的配方組合[3]。目前，國內測定人尿液中他唑巴坦鈉主要采用高效液相色譜（HPLC）法[4-5]，但操作煩瑣、分析時間長。本研究建立了簡便、快速的高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法，用于測定人體內他唑巴坦鈉的尿藥濃度，并研究健康受試者使用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）后他唑巴坦鈉的尿藥排泄特征，現報道如下。

1　材料

1.1儀器

TSQ Ultra EMR型三重四極桿串聯質譜儀、Surveyor型HPLC系統（包括四元梯度泵、溫控自動進樣器和在線脫氣機）和Xcalibur V2.0軟件（美國Finnigan公司）；Milli-Q Gradient A10型超純水器（美國Millipore公司）；TGL-16G型低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BP-211D型電子天平（德國Storius公司）；LP2000-P2型恒速輸液泵（北京鑫禾豐醫(yī)療技術有限公司）；PCB-11型渦旋儀（德國Eppendorf公司）；30AK型氮吹儀（北京八方世紀科技有限公司）。

1.2藥品與試劑

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（南京信業(yè)醫(yī)藥技術有限公司，批號：20090802，規(guī)格：2.34 g）；他唑巴坦鈉對照品（齊魯制藥有限公司，批號：9030064JE，純度：92.0%）；甲醇為色譜純，高氯酸為分析純，水為純凈水。空白尿液由健康受試者提供。

2　方法

2.1色譜與質譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（150 mm×2.1 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（30∶70，V/V）；流速：0.2 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：5μl。

采用電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應選擇監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：4 500 V；金屬毛細管溫度：350℃；鞘氣（N2）壓力：25 Arb；輔助氣（N2）壓力：25 Arb；碰撞氣（Ar）壓力：1.5 mTorr；源內碰撞誘導解離（CID）電壓：2 V；用于定量分析的離子對：m/z 301→168（他唑巴坦鈉）。

2.2標準溶液的配制

精密稱取他唑巴坦鈉對照品適量于量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，配制成他唑巴坦鈉質量濃度為5 000 μg/ml的貯備液。取上述貯備液適量，加水配制成質量濃度分別為2.5、5、10、50、100、500、1 000和5 000 μg/ml的系列標準溶液。

2.3尿液樣品的處理

取尿液50μl，加入10%高氯酸25μl，加水450μl，渦旋混勻10 s，于4℃下以離心半徑3.5 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.2μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液5 μl進樣分析。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性在“2.1”項色譜與質譜條件下，他唑巴坦鈉的保留時間約為2.45 min。尿液中他唑巴坦鈉的色譜圖見圖1。2.4.2標準曲線的繪制與定量下限的考察取空白尿液50 μl，分別加入相應質量濃度的他唑巴坦鈉標準溶液各適量，渦旋混勻，配制成相當于他唑巴坦鈉質量濃度分別為0.25、0.5、1、5、10、50、100、500 μg/ml的含藥尿液樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（As）為縱坐標、待測物質量濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸（權重系數為w＝1/c），得回歸方程為As＝42 900c+1 520（r＝0.999 9）。結果顯示，他唑巴坦鈉尿藥濃度在0.25～500 μg/ml范圍內線性關系良好，定量下限為0.25 μg/ml。

2.4.3精密度與準確度試驗參照《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則》[6]，分別配制他唑巴坦鈉低、中、高質量濃度（0.5、10和500 μg/ml）的含藥尿液樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析；測定3個分析批，根據當批標準曲線計算各樣品的實測質量濃度，考察方法的精密度和準確度。結果顯示，批內、批間RSD＜10%，方法回收率為93.8%～111.8%，詳見表1。

圖1　尿液中他唑巴坦鈉的色譜圖A.空白尿液；B.空白尿液+他唑巴坦鈉（10 μg/ml）；C.受試者靜脈滴注注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉5～8 h的尿液樣本；1.他唑巴坦鈉；2.空白尿液干擾峰Fig 1　Chromatograms of tazobactam sodium in urineA.blank urine；B.blank urine+tazobactam sodium（10 μg/m）；C.urine sample from healthy volunteers 5-8 h after intravenous drip of Cefotaxime sodium tazobactam sodium for injection；1.tazobactam sodium；2. interference peak of blank urine

表1　精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1　Results of recovery and precision tests（±s，n＝5）

表1　精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1　Results of recovery and precision tests（±s，n＝5）

加入質量濃度，μg/ml方法回收率，% 0．5 10．500．批內精密度實測質量濃度，μg/ml 0．50±0．02 10．29±0．68 494．09±19．61 RSD，% 4．5 6．6 4．0批間精密度實測質量濃度，μg/ml 0．51±0．03 10．73±0．57 493．62±17．06 RSD，% 5．7 5．3 3．5 99．9±4．5 102．9±6．6 98．8±4．0

2.4.4提取回收率試驗分別配制他唑巴坦鈉低、中、高質量濃度（0.5、10和500μg/ml）的含藥尿液樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄他唑巴坦鈉峰面積（B1）。取空白尿液50 μl，按“2.3”項下方法處理后，得空白尿液提取液。分別取他唑巴坦鈉標準溶液（5、100和5 000 μg/ml）5μl于離心管中，于37℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣用適量空白尿液提取液復溶，渦旋混勻1 min，于4℃下以離心半徑3.5 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.2μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液5μl進樣分析，記錄他唑巴坦鈉峰面積（A1），上述樣品分別配制5份（最終質量濃度與前者對應）。提取回收率（%）＝B1/A1×100%。結果顯示，各樣品的提取回收率為93.9%～99.7%。

2.4.5穩(wěn)定性考察分別配制他唑巴坦鈉低、中、高質量濃度（0.5、10和500 μg/ml）的含藥尿液樣品各適量，考察各樣品在室溫放置2 h、4℃自動進樣器內放置24 h、冷凍（－70℃）保存15 d（經歷凍融1次）、30 d（經歷凍融2次）等條件下的穩(wěn)定性。結果顯示，各樣品在上述條件下穩(wěn)定性均良好，RSD＜8%。穩(wěn)定性試驗結果見表2。

2.4.6介質效應取空白尿液和水各適量，分別按“2.3”項下方法操作后，得空白尿液提取液和水提取液。采用文獻[7]報道的方法，分別取他唑巴坦鈉標準溶液（5、100和5 000 μg/ml）5 μl于離心管中，于37℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣用空白尿液提取液取或水提取液525μl復溶，渦旋混勻1 min，于4℃下以離心半徑3.5 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.2μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液5μl進樣分析，記錄他唑巴坦鈉峰面積（A2或B2），各質量濃度分別配制5份。介質效應（%）＝A2/B2×100%。結果顯示，他唑巴坦鈉的介質效應為87.6%～107.2%，表明在本試驗條件下，他唑巴坦鈉的測定不受介質效應的干擾[8]。

2.5尿藥排泄動力學研究

2.5.1臨床試驗方案本試驗經國家食品藥品監(jiān)督管理局批準、經南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批同意，在藥物臨床試驗機構進行。所有受試者簽署知情同意書后接受全面體檢，共入組健康受試者8例，其中男性和女性各4例，年齡20～38歲，身高156～178 cm，體質量50～68 kg。受試者在給藥前一天晚上統一進食清淡飲食后，禁食10 h，不禁水過夜。于次日單次靜脈滴注注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉2.34 g，以0.9%氯化鈉注射液250 ml為溶劑，采用恒速輸液泵給藥，滴注時間為60 min。用藥后2 h可進水，進食統一餐。試驗期間受試者均住在病房內，禁服濃茶、咖啡和其他含咖啡因及醇類的飲料。收集各受試者給藥前和給藥后0～2、2～5、5～8、8～12和12～16 h的尿液，記錄每個時間段尿量。

2.5.2計算方法采用Excel 2007計算：各時間段尿液樣品中的藥物濃度測定值與該時間段尿液體積相乘為該時間段藥物排泄量；各時間段藥物排泄量之和為藥物的累積排泄量，其與給藥劑量相比即得相應時間內的藥物累積排泄率。

2.5.3試驗結果8例健康受試者單次給予注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉2.34 g后，尿液中他唑巴坦鈉的排泄量、累積排泄量和累積排泄率見表3，平均累積排泄量-時間曲線見圖2，平均累積排泄率-時間曲線見圖3。結果表明，他唑巴坦鈉在給藥后0～2 h的尿排泄量最大，8 h后基本排泄完全，16 h內尿液中的累積排泄量為（209.70±39.24）mg，累積排泄率為（61.7±11.5）%。

表2　穩(wěn)定性試驗結果（±s，n＝5）Tab 2　Results of stability tests（±s，n＝5）

表2　穩(wěn)定性試驗結果（±s，n＝5）Tab 2　Results of stability tests（±s，n＝5）

加入質量濃度，μg/ml 0．5 10．室溫放置2 h實測質量濃度，μg/ml 0．53±0．02 10．93±0．43 RSD，% 3．8 3．9 4℃自動進樣器內放置24 h實測質量濃度，μg/ml 0．51±0．03 10．85±0．32 RSD，% 5．9 2．9冷凍保存15 d（經歷凍融1次）實測質量濃度，μg/ml 0．54±0．02 10．88±0．58 RSD，% 3．7 5．3冷凍保存30 d（經歷凍融2次）實測質量濃度，μg/ml 0．52±0．04 9．77±0．48 RSD，% 7．7 4．9

表3　他唑巴坦鈉的排泄量、累積排泄量和累積排泄率（±s）Tab 3　Excretion amount，amount and accumulative excretion rate of tazobactam sodium（±s）

表3　他唑巴坦鈉的排泄量、累積排泄量和累積排泄率（±s）Tab 3　Excretion amount，amount and accumulative excretion rate of tazobactam sodium（±s）

參數排泄量，mg累積排泄量，mg累積排泄率，%時間段，h 0～2 164．12±51．50 164．12±51．50 48．3±15．2 2～5 41．96±29．09 206．09±38．99 60．6±11．5 5～8 3．11±2．62 209．19±39．15 61．5±11．5 8～12 0．43±0．25 209．62±39．24 61．7±11．5 12～16 0．09±0．07 209．70±39．24 61．7±11．5

圖2　他唑巴坦鈉的平均累積排泄量-時間曲線Fig 2　Average accumulative excretion amount-time curve of tazobactam sodium

3　討論

采用LC-MS/MS法測定人尿液中他唑巴坦鈉的質量濃度已有文獻報道，但其中并無詳細的方法學考察過程及結果[9]。故本研究在已有文獻的基礎上，對所建立的LC-MS/MS法進行方法學考察。結果顯示，該方法特異性好、靈敏度高。與文獻報道的HPLC-紫外檢測法[4-5]比較，該方法分析時間更短（＜5 min）、線性范圍更寬（0.25～500 μg/ml）。此外，方法學考察結果還顯示，尿液中雜質均不干擾樣本的測定，并可忽略介質效應的影響；批內、批間RSD＜10%，提取回收率為93.9～99.7%；在室溫放置2 h、4℃自動進樣器內放置24 h、冷凍保存15 d和30 d等條件下均穩(wěn)定，符合生物樣品定量分析的要求[7]，可用于人尿液中他唑巴坦鈉濃度的測定和尿藥排泄動力學的研究。

他唑巴坦鈉在正離子條件下有較強且穩(wěn)定的質譜效應，故以正離子方式進行檢測。結果顯示，以ESI為離子源，分子離子峰m/z 301和碎片離子峰m/z 168響應較強，故將定量離子對確定為m/z 301→168。為選擇合適的鞘氣、輔助氣、碰撞氣和CID電壓，筆者分別對不同條件下他唑巴坦鈉離子對的響應值進行了比較，選擇了離子對響應最強的條件為最終的試驗條件。質譜條件經優(yōu)化后，他唑巴坦鈉離子對響應強、靈敏度高。專屬性考察過程中，筆者發(fā)現在，空白尿液的色譜圖（見圖1A）中，2.25 min處有一干擾峰，疑似為空白尿液的內源性物質，但該峰保留時間與他唑巴坦鈉不同，且兩者基線分離。在進行定量分析時，統一了積分參數，在此條件下標準曲線及各樣本的結果均在可接受的范圍內，故該干擾峰對測定結果的影響是可接受的。

本研究根據前期耐受性試驗結果和Ⅱ期臨床試驗可能采用的劑量，將受試者的給藥劑量確定為2.34 g。臨床試驗結果表明，健康受試者單次使用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉16 h后，他唑巴坦鈉累積排泄率為（61.7±11.5）%，且主要經腎臟排泄，與文獻[5-6]的結果相似。頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）制劑尚未在腎功能不全的患者中進行尿藥排泄動力學研究，故在后續(xù)試驗中，應根據患者腎功能損害程度調整本制劑的給藥劑量和間隔時間，為臨床應用提供參考。

（本研究經國家食品藥品監(jiān)督管理局批準，臨床試驗批件號：2005L02508）

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（編輯：張元媛）

Concentration Determination of Tazobactam Sodium in Human Urine by LC-MS/MS and Urinary Excretion Dynamics Study

REN Liling1，WANG Yuanyuan2，SUN Luning2，ZHANG Hongwen2，XIE Lijun2，LIU Yun2，WANG Yongqing1，（21. College of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of tazobactam sodium in human urine，and to study urinary excretion pharmacokinetics.METHODS：The urine samples were extracted by 10%perchloric acid，and then determined by LC-MS/MS.The separation was performed on a Hypersil GOLD C18column with mobile phase consisted of ethanol-water（30∶70，V/V）at flow rate of 0.2 ml/min；the column temperature was set at 30℃，and sample size was 5 μl.ESI was used，and positive ion scanning was conducted in MRM mode；ion pair for quantitative analysis was m/z 301→168.8 healthy volunteers were given Cefotaxime sodium and tazobactam sodium for injection（6∶1，m/m）2.34 g intravenously，and then urine samples were collected before medication，0-2，2-5，5-8，8-12 and 12-16 h after medication.RESULTS：The linear range of tazobactam sodium was 0.25-500 μg/ml（r＝0.999 9）.The limit of quantitation was 0.25 μg/ml；RSDs of inter-batch and intra-batch were all lower than 10%；method recoveries were 93.8%-111.8%；extraction recoveries were 93.9%-99.7%；medium effect ranged 87.6%-107.2%.16 h after medication，accumulative excretion amount of tazobactam sodium in urine was（209.70±39.24）mg and accumulative excretion rate was（61.7±11.5）%.CONCLUSIONS：LC-MS/MS method can be used for the concentration determination of tazobactam sodium in human urine and excretion kinetics study.It is simple，rapid and sensitivity；tazobactam sodium mainly excrete viareral tissue.

LC-MS/MS；Tazobactam sodium；Urine；Urine concentration；Excretion pharmacokinetics

R969.1

A

1001-0408（2016）32-4501-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.32.12

國家自然科學基金（面上項目）（No.81673515）；國家自然科學基金（青年基金項目）（No.81503160）；江蘇省自然科學基金（青年科技人才專項資金）（No.BK20161591）；江蘇省“六大人才高峰”項目（No.2014-YY-001）；江蘇省衛(wèi)生廳面上科研課題（No.H201108）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。電話：025-86816192。E-mail：renliling6@126.com

主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學和臨床藥理學。電話：025-68136984。E-mail：wyqjsph@163.com

（2016-03-08

2016-08-20）