Netrin-1通過下調(diào)氧糖剝奪誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤自噬促進(jìn)細(xì)胞存活

闕嘉麗， 李晨光， 劉可嘉， 余 劍

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Netrin-1通過下調(diào)氧糖剝奪誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤自噬促進(jìn)細(xì)胞存活

闕嘉麗， 李晨光， 劉可嘉， 余 劍

目的 通過建立體外人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)氧糖剝奪(oxygen and glucose deprication，OGD)模型模擬腦梗死后神經(jīng)元缺血缺氧環(huán)境(OGD)，探索神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1是否影響OGD后細(xì)胞的生存，以及自噬在其中的可能作用。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，檢測(cè)Netrin-1對(duì)細(xì)胞活性及自噬的影響。使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干預(yù)自噬水平，同時(shí)構(gòu)建過表達(dá)Netrin-1受體UNC5H2-HA基因的HEK293T細(xì)胞；CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，免疫印跡檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物(Beclin 1、LC3、p62)的表達(dá)及免疫熒光檢測(cè)LC3斑點(diǎn)的形成。結(jié)果 與OGD對(duì)照組相比，Netrin-1及3-甲基腺嘌呤的干預(yù)均顯著提高細(xì)胞活性，伴有LC3-Ⅱ斑點(diǎn)形成減少；相反，雷帕霉素增加LC3-Ⅱ斑點(diǎn)的同時(shí)抑制細(xì)胞活性，并減弱了Netrin-1提高細(xì)胞活性的作用。過表達(dá)UNC5H2-HA細(xì)胞較對(duì)照質(zhì)粒組相比，LC3-Ⅱ表達(dá)增加；同時(shí)進(jìn)行Netrin-1干預(yù)后僅過表達(dá)組出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達(dá)下降，p62表達(dá)上升。結(jié)論 Netrin-1可能通過受體UNC5H2下調(diào)OGD損傷的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤自噬而提高細(xì)胞活性。

Netrin-1； 氧糖剝奪； 自噬； UNC5H2

腦卒中是導(dǎo)致我國(guó)成人殘疾和死亡的第一原因[1]。腦梗死后神經(jīng)元自噬過程被激活，研究發(fā)現(xiàn)降低自噬活性能夠降低神經(jīng)元死亡數(shù)量，減小梗死面積并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[2,3]，但其調(diào)節(jié)因素尚未完全闡明。作為一種神經(jīng)導(dǎo)向因子，Netrin-1不僅在發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移黏附[4]，而且在成年后與依賴性受體UNC5H2結(jié)合后，顯著地減少腦卒中后細(xì)胞凋亡，并改善運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[5～7]，提示其在腦保護(hù)作用上具有治療潛能。

進(jìn)一步地研究顯示Netrin-1在減少缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的同時(shí)也顯著地降低了自噬活性[8]，但在腦梗死后尚缺乏兩者的研究。

本實(shí)驗(yàn)利用穩(wěn)定表達(dá)Netrin-1及其受體UNC5H2的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)建立模擬腦梗死環(huán)境的體外氧糖剝奪細(xì)胞模型[9,10]，同時(shí)構(gòu)建UNC5H2過表達(dá)的HEK 293T細(xì)胞系，旨在探討Netrin-1對(duì)缺氧損傷后自噬及細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用，以及其受體UNC5H2對(duì)細(xì)胞自噬的影響，為Netrin-1的腦保護(hù)作用探尋新的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及建立過表達(dá)體系 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)、HEK 293T細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC)公司。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換培養(yǎng)液一次，生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)傳代，取第2-7代細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HEK 293T細(xì)胞按104/ml的密度種植于六孔板及培養(yǎng)皿中，12 h貼壁后，按Lipofectamine 3000(Life Technologies)說明書步驟瞬轉(zhuǎn)UNC5H2-HA-tag質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒(吉?jiǎng)P生物),使用HA抗體(1∶1000，Abcam)進(jìn)行免疫熒光法測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，觀察計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞并計(jì)算帶綠色熒光的細(xì)胞的比例。

1.2 OGD模型建立 該模型用于模擬體內(nèi)腦梗死環(huán)境并進(jìn)行自噬和細(xì)胞活性檢測(cè)[11]。SH-SY5Y按105/ml正常接種于96孔板后，吸凈原有培養(yǎng)基，更換成DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco)，置于含有氧氣指示劑(日本三菱)的缺氧罐內(nèi)，使用真空抽氣泵抽空罐內(nèi)空氣后，通入由95%N2及5%CO2組成的混合氣體，反復(fù)抽吸3次構(gòu)建缺氧環(huán)境，氧氣指示劑持續(xù)顯示粉紅色表明缺氧過程成功，最后將缺氧罐放置在37 ℃恒溫箱中2 h后置于正常氧糖環(huán)境中。

1.3 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性 SH-SY5Y接種于96孔板中，接種密度為105/孔，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，分別加入以下藥物：對(duì)照組(不加藥)；Netrin-1組(50 ng/ml)；自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素組(Rapamycin,RAPA,50 nmol/L)；Netrin-1+RAPA組；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,1mmol/L)；Netrin-1+3-MA組。藥物預(yù)處理2 h后置于OGD模型中，2 h后每孔加入10 μl CCK-8(日本同仁)，37 ℃孵育1.5 h后用酶標(biāo)儀在450 mm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，計(jì)算相對(duì)吸光度，吸光度越高，細(xì)胞活性越高。

1.4 免疫熒光檢測(cè)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3斑點(diǎn)形成 SH-SY5Y經(jīng)100%甲醇固定15 min，0.01 mol PBS搖床洗5 min 3次，加入封閉液封閉1 h后孵育兔抗大鼠LC3一抗(1∶100，CST)檢測(cè)LC3斑點(diǎn)形成，4 ℃冰箱放置過夜，加入delight 555標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶600，CST)室溫孵育1 h后再漂洗，封片后于共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 Western blot HEK 293T細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(博彩生物)提取蛋白，BCA試劑盒(Thermo)進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，蛋白樣品(每孔40 μg)進(jìn)行12% SDS-PAGE垂直電泳，恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗人一抗UNC5B、Beclin 1、p62、LC3及GAPDH，4 ℃孵育過夜，次日加入抗兔二抗室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光HRP底物(Millipore)于熒光化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Image Quant Las4000 mini)中曝光成像，采用Quantity One 分析條帶灰值。

2 結(jié) 果

2.1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 各組經(jīng)OGD處理后，與OGD對(duì)照組(0.63±0.03)相比，Netrin-1組(0.77±0.04)、3-MA組(0.76±0.03)以及3-MA+Netrin-1組(0.77±0.04)明顯增強(qiáng)SH-SY5Y活性(P均<0.05)；而RAPA組(0.63±0.01)對(duì)細(xì)胞活性影響不明顯；與Netrin-1組相比，RAPA+Netrin-1組(0.65±0.02)的細(xì)胞活性下降(P<0.05)(見圖1)，表明50 nmol/L RAPA能夠有效減弱OGD后Netrin-1對(duì)細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用，而3-MA對(duì)此無明顯影響。

2.2 免疫熒光檢測(cè)LC3斑點(diǎn)形成 微管相關(guān)蛋白LC3是自噬標(biāo)志物。自噬小體形成時(shí)，胞漿型LC3即LC3-I與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合，形成結(jié)合在自噬小體膜上的斑點(diǎn)狀LC3-Ⅱ(見圖2)。OGD時(shí)SH-SY5Y胞質(zhì)中可見大量LC3斑點(diǎn)形成，RAPA作用后斑點(diǎn)明顯增加，但Netrin-1組及3-MA組、Netrin-1+3-MA組則出現(xiàn)斑點(diǎn)數(shù)目明顯減少，提示Netrin-1減輕SH-SY5Y自噬活性。另外，Netrin-1+RAPA組的斑點(diǎn)數(shù)較Netrin-1組增加。

2.3 Western blot 過表達(dá)UNC5H2-HA組較對(duì)照質(zhì)粒組LC3-Ⅱ/GAPDH比值增高(P<0.05)；對(duì)照質(zhì)粒組中進(jìn)行Netrin-1干預(yù)對(duì)自噬標(biāo)志物無明顯變化，而在UNC5H2-HA組中Netrin-1干預(yù)使LC3-Ⅱ相對(duì)比值下降，及Beclin 1相對(duì)下降，p62相對(duì)升高(P<0.05)，提示細(xì)胞自噬活性降低(見圖3)。

與對(duì)照組相比*P<0.05；與Netrin-1組相比#P<0.05

圖1 CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性

A：對(duì)照組；B：RAPA組；C：3-MA組；D：Netrin-1組；E：RAPA+Netrin-1組；F：3-MA+Netrin-1組 紅色熒光為L(zhǎng)C3-Ⅱ蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，1000×，標(biāo)尺=5μm

圖2 LC3免疫熒光染色

A：蛋白泳道從左到右：vehicle組,vehicle組+Netrin-1，UNC5H2-HA組，UNC5H2-HA組+Netrin-1；B：Beclin 1蛋白的相對(duì)比值變化；C：p62蛋白的相對(duì)比值變化；D：LC3-Ⅱ蛋白的相對(duì)比值變化與vehicle對(duì)照組相比*P<0.05； 與UNC5H2-HA組相比#P<0.05

圖3 過表達(dá)UNC5H2-HA及添加Netrin-1后的自噬標(biāo)志物表達(dá)改變

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性和自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD后SH-SY5Y自噬增強(qiáng)，細(xì)胞活性降低，而給予Netrin-1預(yù)處理后，自噬明顯減弱并伴細(xì)胞活性增強(qiáng)，這種增強(qiáng)作用可被自噬誘導(dǎo)劑RAPA所減弱。另外，過表達(dá)UNC5H2的HEK 293T細(xì)胞也出現(xiàn)自噬增強(qiáng)，并且Netrin-1僅減弱該過表達(dá)系的自噬活性，提示Netrin-1在體外對(duì)OGD后的SH-SY5Y生存具有保護(hù)作用，且該保護(hù)作用可能通過UNC5H2介導(dǎo)降低自噬而實(shí)現(xiàn)。

自噬過程與細(xì)胞死亡密切相關(guān)，并受mTOR、PI3K等多種因素調(diào)控，適量的自噬有助于適應(yīng)外界刺激促進(jìn)細(xì)胞存活，而過量的自噬則有可能加速細(xì)胞的死亡[12,13]。腦梗死后早期病灶周圍神經(jīng)元自噬即顯著增強(qiáng)，但其作用尚存爭(zhēng)議。一般認(rèn)為這種自噬激活是一種損傷機(jī)制[14]。注射自噬抑制劑[10,15]或敲除自噬相關(guān)基因Beclin 1[16]后均可減少腦梗死面積并改善神經(jīng)功能；但也有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為自噬激活具有保護(hù)作用，在側(cè)腦室注入自噬抑制劑預(yù)處理后腦梗死面積反而增大[17]，這可能與所使用的動(dòng)物模型、藥物劑量和觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)等不同相關(guān)[15,17]。本實(shí)驗(yàn)采用的神經(jīng)源性細(xì)胞SH-SY5Y與原代神經(jīng)元自噬活性相當(dāng)，采用的50 nmol/L的RAPA和1 mmol/L的3-MA在保留有效調(diào)控自噬的同時(shí)可盡量避免對(duì)細(xì)胞造成損傷[18]。在該條件下通過觀察OGD后自噬對(duì)SH-SY5Y的影響，發(fā)現(xiàn)OGD后自噬增強(qiáng)不利于該細(xì)胞的生存，而Netrin-1對(duì)其生存的促進(jìn)作用則是通過減弱這種自噬來實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3的減低和p62的增高。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Netrin-1能夠減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡并改善神經(jīng)功能恢復(fù)[5～7]，同時(shí)，Netrin-1與其依賴性受體UNC5H2結(jié)合后能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[19]。為進(jìn)一步了解是否UNC5H2也介導(dǎo)Netrin-1對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用，我們構(gòu)建了過表達(dá)UNC5H2的HEK 293T細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UNC5H2明顯提高細(xì)胞的自噬活性，而同時(shí)給予Netrin-1干預(yù)后可減低這種自噬活性，提示Netrin-1/UNC5H2可能是自噬調(diào)節(jié)中的重要因素。

有研究發(fā)現(xiàn)UNC5在線蟲神經(jīng)元中與自噬相關(guān)基因UNC-51及UNC-14密切相關(guān)，后兩者可協(xié)同定位UNC-5的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并引導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)[20]。另外，Netrin-1/UNC5H2介導(dǎo)的細(xì)胞存活的下游分子DAPK[21]也可能通過激活Beclin 1而啟動(dòng)自噬途徑[22]，但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)Netrin-1的其他受體，如DCC、neoginin等，尚不能除外這些受體也在Netrin-1對(duì)自噬的調(diào)控起作用，這有待于今后深入研究。

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Netrin-1 protects SH-SY5Y neuroblastoma cells from oxygen-glucose deprivation by attenuating autophagy

QUE Jiali,LI Chenguang,LIU Kejia,et al.

(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)

Objective To mimic hypoxic and ischemia environment caused by stroke,in vitro oxygen-glucose deprivation (OGD) model was established.The aim is to explore whether axon guidance factor Netrin-1 protectes SH-SY5Y neuroblastoma cells from OGD by regulating autophagy.Methods SH-SY5Ys were pretreated with Netrin-1 before OGD，apply applied autophagy inducer rapamycin and autophagy inhibitor 3-methyladeni-ne (3-MA) to modulate the autophagy flow,and transient transfected HEK 293T cell with UNC5H2-HA plasmid;cell viability was examined in CCK8 assay,western Western blot detected the autophagy markers (Beclin1,LC3,p62) and immunofluorescence detected punctuate LC3.Results We found that Netrin-1 improved cell viability and decreased the expression of LC3-Ⅱ,a protein related to autophagosome formation,in a manner sensitive to RAPA co-treatment.Additionally,the ability of Netrin-1 to decrease the expression of LC3-Ⅱ was present in UNC5H2-overexpressing HEK 293T cells but not vehivle-transfected cells,indicated the importance of Netrin-1-UNC5H2 interaction to this effect.Conclusion These results indicate that Netrin-1 may improve cell survival by attenuat-ing autophagy via UNC5H2.

Netrin-1; Oxygen-glucose derivation; Autophagy; UNC5H2

1003-2754(2016)06-513-04

2016-02-23；

2016-05-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81371276)；廣東省自然科學(xué)基金(No.2014A030313065)；廣東省重大神經(jīng)疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No.2014B030301035)

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，衛(wèi)生部國(guó)家臨床重點(diǎn)專科，教育部國(guó)家重點(diǎn)專科，廣東 廣州 510080)

余 劍，E-mail：yujian21cn@163.com

R739.4

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