尿液線粒體DNA突變檢測篩查線粒體腦肌病方法研究

陳 蕊， 漆學良， 張 明， 丁衛(wèi)江

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尿液線粒體DNA突變檢測篩查線粒體腦肌病方法研究

陳 蕊， 漆學良， 張 明， 丁衛(wèi)江

目的 分析線粒體腦肌病患者血液及尿液中線粒體DNA突變情況，提供無創(chuàng)基因檢測方法的證據(jù)支持。 方法 采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，限制性內(nèi)切酶酶切等方法對患者進行線粒體基因分析，對患者血液、尿液標本中線粒體DNA突變情況進行檢測，篩查并確診線粒體腦肌病。結(jié)果 7例患者被確診為A3243G雜合突變，血、尿標本中突變負荷分別為17.80%和60.16%、20.88%和73.96%、29.62%和92.58%、36.01%和91.29%、5.14%和48.78%、5.74%和58.57%、0.57%和5.99%。結(jié)論 線粒體腦肌病患者尿液中線粒體DNA突變率明顯高于血液中的突變率，且尿液標本為無創(chuàng)取得，可作為基因檢測的首選標本。

尿液； 基因； 線粒體腦肌病

線粒體腦肌病(mitochondrial encephalomyopathy)是由線粒體基因(mtDNA)和/或核基因(nDNA)突變，致使線粒體功能障礙，不能正常供能，進而產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)的一組疾病。兒童起病的線粒體腦肌病多由nDNA突變所致，而常見的成人線粒體腦肌病大多由mtDNA突變引起[1]，本研究主要針對后者。自1988年首次將mtDNA的突變與人類疾病相聯(lián)系以來，線粒體醫(yī)學不斷的被深入研究，基因檢測為確診該疾病的金標準，但由于線粒體疾病異質(zhì)性的特點，對基因檢測所用標本的選擇十分重要。本研究采用尿液mtDNA突變檢測來篩查線粒體腦肌病，同時用常用的血液標本做對照，并對陽性標本的mtDNA突變量進行分析。

1 資料及方法

1.1 入選標準 (1)母系遺傳伴身材矮小的不明原因糖尿病、耳聾、心肌病或癲癇患者；(2)小于45歲反復卒中樣發(fā)作患者；(3)嚴重多器官系統(tǒng)受累，或2個以上器官系統(tǒng)受累而緩慢惡化者；(4)懷疑線粒體腦肌病但肌肉活檢陰性者；(5)波動性與活動明顯相關(guān)的肌無力患者；(6)肌肉活檢證實但未行基因檢測的患者；(7)確診線粒體病患者的直系親屬。本研究為篩查實驗，正常人群無突變位點，故無排除標準以及健康對照組。

1.2 檢測方法 對所有入選者進行A3243G、A8344G、T8993C、T8993G、G13513A突變檢測。對同一患者留取抗凝全血3 ml，晨尿100 ml，根據(jù)基因提取試劑盒步驟進行血、尿標本的DNA提取，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行3243、8344、8993、13513位點擴增,引物及退火溫度(見表1)，PCR 反應(yīng)體積為25 μl ，含25～50 ng 樣品DNA，0.4 mol/L 引物，0.2 mmol/L 三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)，1 mmol/L Mg2+，1單位Taq 酶，反應(yīng)條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 變性30 s，適宜退火溫度 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35 個循環(huán)，末次循環(huán)結(jié)束后以72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行酶切，反應(yīng)體積為20 μl，依次加入三蒸水5 μl，酶切緩沖液2 μl，乙酰化牛血清蛋白2 μl,PCR產(chǎn)物10 μl，限制性內(nèi)切酶1 μl，37 ℃反應(yīng)8 h，酶切后2%瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外光下觀察有無上述位點突變， ApaⅠ可將A3243G突變的產(chǎn)物切割為366 bp+128 bp，無突變時不被切割；BglⅠ可將A8344G突變產(chǎn)物切割為73 bp+35 bp，無突變時不被切割；smaⅠ可將T8993G突變產(chǎn)物切割為306 bp+97 bp，無突變時不被切割；MspⅠ可將無突變的8993擴增片段切割為396 bp+7 bp，發(fā)生T8993C/G突變后將396片段切割為300 bp+96 bp；MboⅠ可將無突變的13513片段切割為144 bp+26 bp，發(fā)生G13513A突變后，切割位點消失，不發(fā)生片段切割。用凝膠分析軟件對電泳條帶進行吸光度分析，計算突變負荷(突變負荷=突變條帶吸光度/總條帶吸光度之和×100%)。

2 結(jié) 果

2014年6月-2015年9月期間共篩查疑似病例14例，男性7例，女性7例。其中共7例患者發(fā)現(xiàn)了mtDNA突變(分別編號1-7)，均為A3243G點突變，男性3例，女性4例，平均年齡32歲，平均起病年齡20歲，其中1例為既往確診，6例新確診，臨床表現(xiàn)癲癇發(fā)作3例，糖尿病或糖耐量異常3例，聽力損害2例，記憶力減退2例，偏頭痛1例，無癥狀患者1例。7例患者包括了2例散發(fā)(1號、2號)，2個家系(5號為3號、4號的母親，7號為6號母親)。

7例患者血、尿標本mtDNA的PCR產(chǎn)物中至少有一種被ApaⅠ部分切割為兩條帶(見圖1)，證實存在A3243G點突變，即線粒體腦肌病伴乳酸血癥及卒中樣發(fā)作(MELAS)，突變負荷計算結(jié)果(見表2)，同一患者尿液標本中mtDNA突變負荷明顯高于血液，增加酶量和延長反應(yīng)時間結(jié)果無變化。

表2 1-7號患者血液、尿液標本中突變量

圖1 7例患者血液、尿液標本3243位點擴增后片段大小494 bp，用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ進行酶切后，至少一種樣本中產(chǎn)物部分被切割為366 bp+128 bp

3 討 論

線粒體是一種供能細胞器，生成ATP并維持細胞正常功能，線粒體含有自身DNA，編碼了13種蛋白，2種rRNA，22種tRNA，mtDNA的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、修復由核基因編碼的蛋白控制[2]。任何可以導致線粒體功能障礙的突變均可以引起線粒體疾病，由于mtDNA裸露而無蛋白保護，且缺少自我修復功能，使其較nDNA更易受到損傷。線粒體疾病具有特殊的遺傳學特征：(1)異質(zhì)性和閾值效應(yīng)；(2)有絲分裂分離引起同一個體表型改變；(3)母系遺傳。

線粒體的致病突變包括點突變、片段的缺失或重復，根據(jù)mtDNA不同突變類型以及臨床表現(xiàn)，線粒體腦肌病的臨床分類較多，包括：MELAS、肌陣攣癲癇伴破碎樣紅纖維(MERRF)、Leigh綜合征(LS)、Kearns-Sayer綜合征(KSS)、慢性進行性眼外肌癱瘓(CPEO)等[3]，MELAS與mtDNA的A3243G突變有關(guān)；MERRF與A8344G突變有關(guān)；LS與T8993G/C突變有關(guān)；KSS及CPEO與大片段缺失有關(guān)；G13513A突變既可以導致MELAS，也可表現(xiàn)為LS[4]。線粒體疾病中，一個基因突變可引起多種臨床癥狀，一種臨床表現(xiàn)可由多種基因突變引起，MELAS為最常見的線粒體腦肌病類型，目前已知有20多種mtDNA的突變類型可以引起MELAS，MT-TL1基因3243位點發(fā)生A-G突變是最常見突變類型[5]，突變后tRNALeu(UUR)合成受阻，蛋白合成障礙，線粒體氧化磷酸化功能受阻，繼而影響供能[6]。與報道一致，本研究中大多診斷為MELAS，且為A3243G突變。

線粒體疾病是一組進行性發(fā)展且累及多個系統(tǒng)的疾病，線粒體功能障礙主要影響能量代謝旺盛的組織器官，例如心臟、骨骼肌、腎臟、內(nèi)分泌器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、消化道黏膜等均為易受累器官，多系統(tǒng)疾病應(yīng)高度懷疑線粒體疾病。隨著病情進展，細胞內(nèi)突變線粒體載量的改變，細胞表型發(fā)生改變，有些患者會隨著疾病的進展出現(xiàn)多種臨床表型，MELAS患者主要表現(xiàn)為青年卒中樣發(fā)作、癲癇、耳聾、糖尿病等[7，8]。本研究中未發(fā)現(xiàn)MELAS典型的青年卒中樣發(fā)作患者，可能與樣本量較少有關(guān)。大約1/3的MELAS患者會出現(xiàn)癲癇發(fā)作，以強直陣攣發(fā)作和復雜部分性發(fā)作多件，腦電圖的特異性需要大樣本量進一步研究[9]。本研究中42.86%的患者出現(xiàn)癲癇發(fā)作。研究顯示[10]，mtDNA突變載量越高，起病越早，且癥狀越重。本研究中，7號患者為無癥狀患者，其血尿中的mtDNA突變量均明顯低于有癥狀患者。

線粒體腦疾病的臨床表現(xiàn)多樣，造成診斷困難，常用的檢測手段有血乳酸丙酮酸最小運動量試驗，肌肉活檢病理檢測，影像學檢查，基因檢測。血乳酸丙酮酸最小運動量試驗受到患者基礎(chǔ)體質(zhì)、操作方法等多種因素影響，應(yīng)用較局限[11]，血和腦脊液中的乳酸水平升高可以提示線粒體腦肌病，但特異性及敏感性有限。MRI的應(yīng)用對診斷起到一定作用，與血管分布不一致的類梗死病灶是特征性改變，MRS見病灶區(qū)異常乳酸峰，不論急性期還是間歇期，MELAS患者腦組織攝氧分數(shù)均降低，包括病灶區(qū)域未受累區(qū)域[12]，雖然MRI可高度提示診斷，但并不能確診。肌肉活檢發(fā)現(xiàn)破碎紅纖維及COX陰性染色纖維，或者SDH深染血管，電鏡下見膜下異常的線粒體聚集及結(jié)構(gòu)排列異常可以診斷線粒體肌病[13]，但肌肉出現(xiàn)明顯的病理改變多見于臨床表現(xiàn)較重時，不利于早期篩查。基因檢測發(fā)現(xiàn)突變位點是診斷線粒體病的金標準，肌肉組織是較為可靠的檢測標本，但需有創(chuàng)操作獲取，患者不易接受，血液標本臨床上較易獲得，血液中的線粒體DNA主要來自于白細胞，白細胞是一種快速分裂細胞，在體內(nèi)的生存周期僅為數(shù)天，線粒體突變水平較低，易出現(xiàn)假陰性。尿液中的線粒體DNA 來自于腎盂、輸尿管、膀胱、尿道脫落的移行上皮細胞，突變載量高，尿液可能是較為適宜的基因檢測標本[14]。

患者不同組織中mtDNA突變載量不同，可能與以下原因有關(guān)：(1)尿路上皮在發(fā)生上來源于胚胎內(nèi)胚層，骨骼肌和血液系統(tǒng)來源于中胚層，內(nèi)胚層細胞較大，含卵黃較多，在沒有臨床癥狀表現(xiàn)時，內(nèi)胚層的突變負荷高于中胚層及外胚層，與之相一致的是，由于形成肌肉的體節(jié)在發(fā)育過程中的移動，使得上肢成肌細胞的突變載量高于下肢[15]；(2)組織的突變負荷和能量需求影響表型，神經(jīng)元及肌細胞是不分裂且高耗能細胞，使得突變的線粒體易于積攢，根據(jù)達爾文的進化論，在分裂后的子細胞中，機體傾向于保留正常的子細胞，而淘汰突變線粒體含量高、功能受損的細胞，特別是在高耗能細胞中更明顯，而低耗能細胞中，這種淘汰競爭傾向并不明顯，使得有缺陷的線粒體得以存在并積累[16]，血液細胞為高耗能，分裂迅速，細胞壽命短，使突變線粒體積累少，而尿路上皮細胞分裂活躍，但耗能少，使得突變的線粒體更易積累[17]；(3)隨著年齡的增長，血液中的突變載量下降明顯，而肌肉和尿路上皮相對穩(wěn)定。但是肌肉活檢不能完全被代替，因為血尿標本無法進行免疫組化檢查，而且，線粒體片段缺失，目前只從肌肉標本中檢測到[18]。本研究中篩查診斷的病例均為A3243G突變，未發(fā)現(xiàn)所測位點突變的患者可能為少見突變位點，陽性標本中，尿液線粒體突變負荷明顯高于血液標本中，電泳條帶中，尿中的突變條帶亮度明顯高于血液中的條帶，而且，尿液標本易于獲取，對于癥狀較輕及無癥狀的患者家屬，無創(chuàng)操作更易被接受，可作為檢測的理想標本。

目前對于線粒體疾病的治療方法，仍以對癥治療為主，主要有藥物、輸血、血液透析、侵入性治療、手術(shù)、飲食、理療等，其中藥物治療仍為基礎(chǔ)治療，藥物治療可分為針對各種臨床表現(xiàn)使用的特異性藥物，針對改善線粒體功能、清除有毒代謝產(chǎn)物的非特異性藥物，同時需要避免使用對線粒體功能有影響的藥物[19]。研究顯示[20]，3243突變攜帶的孕婦易伴有胚胎發(fā)育異常，更易出現(xiàn)高血壓、子癇、糖尿病等產(chǎn)科并發(fā)癥，需要更密切的關(guān)注，及時發(fā)現(xiàn)并予以指導、干預，如何使這些患者孕育出健康胎兒，是具有重要意義的研究方向。有人用運動試驗和31P-MRS技術(shù)，證實L-精氨酸的可以提高MELAS患者全身有氧工作能力及改善肌肉代謝，并提出，低鎂血癥可能是引起MELAS卒中樣發(fā)作的新機制，而補充鎂劑可作為新的預防、治療MELAS的方法[21]。隨著分子生物學的進展，采用誘導多能干細胞技術(shù)，成功建立體外線粒體腦肌病細胞模型，有助于深入了解線粒體腦肌病的病理生理機制，為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了研究基礎(chǔ)，更預示著細胞替代療法及基因治療的潛在價值[22]。

4 結(jié) 論

線粒體腦肌病是一種母系遺傳疾病，部分散發(fā)，臨床上以A3243G位點突變的MELAS最為多見，診斷依靠多種手段，基因檢測為確診標準，選擇合適基因檢測標本，可提高診斷率，尿液中mtDNA的突變負荷高于血液，與肌肉標本相比為無創(chuàng)操作，易于接受，檢出率高，可作為篩查、早起診斷的首選檢測標本，對于不易診斷的，可進一步行肌肉檢測、全基因測序。目前仍需要進一步的研究來尋找合適的治療方法。

[1]Haas RH,Parikh S,Falk MJ,et al.Mitochondrial disease:a practical approach for primary care physicians[J].Pediatrics,2007,120(6):1326-1333.

[2]Koopman WJ,Willems PH,Smeitink JA.Monogenic mitochondrial disorders[J].N Engl J Med,2012,366(12):1132-1141.

[3]Andreu AL,DiMauro S.Current classification of mitochondrial disorders[J].J Neurol,2003,250(12):1403-1406.

[4]魏曉瓊,孔慶鵬,張 堯,等.線粒體基因13513G>A突變導致呼吸鏈酶復合物I缺陷Leigh綜合征[J].中國當代兒科雜志,2009,05:333-336.

[5]Tuppen HA,Blakely EL,Turnbull DM,et al.Mitochondrial DNA mutations and human disease[J].Biochim Biophys Acta,2010,1797(2):113-128.

[6]DiMauro S,Schon EA.Mitochondrial respiratory-chain diseases[J].N Engl J Med,2003,348(26):2656-2668.

[7]Schinwelski M,Kierdaszuk B,Dulski J,et al.Changing phenotypic expression in a patient with a mitochondrial encephalopathy due to 13042G>A de novo mutation-a 5 year follow up[J].Metab Brain Dis,2015,30(4):1083-1085.

[8]Picard M,Zhang J,Hancock S,et al.Progressive increase in mtDNA 3243A>G heteroplasmy causes abrupt transcriptional reprogramming[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(38):4033-4042.

[9]Chevallier JA,Von Allmen GK,Koenig MK.Seizure semiology and EEG findings in mitochondrial diseases[J].Epilepsia,2014,55(5):707-712.

[10]Li W,Zhang W,Li F,et al.Mitochondrial genetic analysis in a Chinese family suffering from both mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes and diabetes[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(6):7022-7027.

[11]孫永安,褚文正,謝安木,等.乳酸丙酮酸最小運動量試驗在線粒體肌病臨床檢查中的應(yīng)用[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2010,1:47-49.

[12]Yu L,Xie S,Xiao J,et al.Quantitative measurement of cerebral oxygen extraction fraction using MRI in patients with MELAS[J].PLoS One,2013,8(11):e79859-79866.

[13]Lorenzoni PJ,Scola RH,Kay CS,et al.MELAS:clinical features,muscle biopsy and molecular genetics[J].Arq Neuropsiquiatr,2009,67(3A):668-676.

[14]de Laat P,Koene S,van den Heuvel LP,et al.Clinical features and heteroplasmy in blood,urine and saliva in 34 Dutch families carrying the m.3243A>G mutation[J].J Inherit Metab Dis,2012,35(6):1059- 1069.

[15]Marotta R,Reardon K,McKelvie PA,et al.Association of the MELAS m.3243A>G mutation with myositis and the superiority of urine over muscle,blood and hair for mutation detection[J].J Clin Neurosci,2009,16(9):1223-1225.

[16]Sue CM,Quigley A,Katsabanis S,et al.Detection of MELAS A3243G point mutation in muscle,blood and hair follicles[J].J Neurol Sci,1998,161(1):36-39.

[17]Ma Y,Fang F,Yang Y,et al.The study of mitochondrial A3243G mutation in different samples[J].Mitochondrion,2009,9(2):139-143.

[18]Frederiksen AL,Andersen PH,Kyvik KO,et al.Tissue specific distribution of the 3243A->G mtDNA mutation[J].J Med Genet,2006,43(8):671-677.

[19]Finsterer J.Treatment of mitochondrial disorders[J].European Journal of Paediatric Neurology,2010,14(1):29-44.

[20]de Laat P,Fleuren LH,Bekker MN,et al.Obstetric complications in carriers of the m.3243A>G mutation,a retrospective cohort study on maternal and fetal outcome[J].Mitochondrion,2015,5:98-103.

[21]Rodan LH,Wells GD,Banks L,et al.L-arginine affects aerobic capacity and muscle metabolism in MELAS (mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis and stroke-like episodes) syndrome[J].PLoS One,2015,10(5):e0127066.

[22]Kodaira M,Hatakeyama H,Yuasa S,et al.Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels[J].FEBS Open Bio,2015,5:219-525.

Study of screening for mitochondrial encephalomyopathy by mtDNA mutation detection of urine

CHEN Rui,QI Xueliang,ZHANG Ming,et al.

(Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital to Nanchang University,Nanchang 330006,China)

Objective To analyze the mtDNA mutation of blood and urine from mitochondrial encephalomyopathy patients and supply the evidentiary support of noninvasive gene tests.Methods Using polymerase chain reaction(PCR) and restriction enzyme reaction to test the mtDNA mutation in urine and blood.Screening and diagnosis of mitochondrial encephalomyopathy.Results Seven patients were diagnosised as m.3243A>G heterozygous mutation.Mutation ratio in blood and urine were 17.80% and 60.16%、20.88% and 73.96%、29.62% and 92.58%、36.01% and 91.29%、5.14% and 48.78%、5.74% and 58.57%、0.57% and 5.99%.Conclusion The mutation ratio of mtDNA was significantly higher in urine than in blood in mitochondrial encephalomyopathy patients.Measurement of mt DNA mutation ratio in urine is a non-invasive method and could be preferred sample.

Urine； Gene； Mitochondrial encephalomyopathy

1003-2754(2016)06-0500-04

2016-02-03；

2016-03-29

江西省科技計劃項目(No.20132BBG70077)

(南昌大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江西 南昌 330006)

漆學良，E-mail：qixueliang766@163.com

745.1

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