NOTCH3基因測序發現一個新的致病突變CADASIL診斷的復雜性

林 晶， 姬曉曇， 王迪龍， 范玉華

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NOTCH3基因測序發現一個新的致病突變CADASIL診斷的復雜性

林 晶， 姬曉曇， 王迪龍， 范玉華

目的 通過一個新發現的伴皮質下梗死和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)致病基因,說明基因測序對于CADASIL診斷的必要性及CADASIL診斷的復雜性。方法 對1例疑似CADASIL患者的臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查、家系及基因測序進行分析。臨床上主要表現為反復缺血性卒中及進行性記憶力下降；實驗室檢查排除一些高凝疾病及血管炎；頭部MRI提示皮質下白質廣泛對側性信號異常及多部位的新舊梗死病灶；家系分析患者家族成員存在偏頭痛、反復卒中及記憶力下降；基因測序提示NOTCH3基因3號外顯子存在一個基因突變(c.331G>T p.Gly111Cys)，而這個突變位點截止到目前并未報道過。結果 結合患者臨床表現、影像學、家系及基因測序分析確診該患者為CADASIL，通過分析CADASIL突變基因的致病機制確認該患者存在的突變基因為CADASIL一個新發現的致病突變。結論 新的CADASIL致病基因突變的發現強調了基因測序及提高對突變基因致病機制認識的重要性。

CADASIL； NOTCH3； 新的突變； 基因測序； 外顯子

CADASIL是一種遺傳性腦小血管病，臨床上主要表現為反復的腦缺血發作、先兆偏頭痛、認知功能障礙等異常。影像學以MRI T2像與Flair出現顳極和外囊的腦白質高信號為主要特點，側腦室旁斑點狀腦白質疏松逐步進展為廣泛的腦白質病變是診斷CADASIL的有力補充[1]。

CADASIL的致病基因是位于19號染色體短臂的NOTCH3，該基因有33個外顯子編碼，是由2321個氨基酸構成的單次跨膜異二聚體受體蛋白Notch3，Notch3主要包括3個區域：胞外域(Notch3 extracellular domain，N3ECD)主要由34個表皮生長因子樣重復序列(epidermal growth factor-like repeat，EGFr)構成、跨膜域、胞內域；其中每個EGFr包含6個半胱氨酸殘基。目前有超過230種不同的致病突變報道，大部分集中在NOTCH3的2-24號外顯子，其中3號外顯子及4號外顯子是突變熱點。

臨床表現及影像學可以為診斷CADASIL提供初步的參考證據，但CADASIL的診斷金標準是基因檢測，盡管CADASIL被證明是腦小血管病，但微小動脈內膜平滑肌退行性變及顆粒狀嗜鋨樣物質(granular osmiophilic material，GOM)沉積是系統性改變，皮膚小血管也存在同樣病變，當基因檢測發現未曾報道的突變基因時，皮膚活檢可以作為重要的協診依據。

目前針對CADASIL無特異性治療，兩種基因治療-使用抑制性RNA分子使突變等位基因沉默或抗轉錄治療介導的NOTCH3包含缺陷序列的外顯子跳躍將有望成為CADASIL特異性有效治療；現在對CADASIL只能對癥治療，例如節制吸煙、傳統止痛藥治療偏頭痛；抗凝藥物及抗血小板藥物已經證明無明確療效，卻會增加出血風險；關于認知功能障礙、膽堿酯酶抑制劑也許有效，有報道多奈哌齊可以適度改善執行功能但是機制并清楚[2]。

1 方法與結果

患者,男性，37歲。主要以突發左側肢體無力及進行性記憶力下降入中山大學附屬第一醫院神經科，患者有6 y前突發言語不清、飲水嗆咳及1 y前突發左側肢體麻木病史，既往無記憶力或計算力下降、失語等認知功能障礙、情感障礙及偏頭痛等病史，無高血壓、糖尿病、房顫等病史，有大量吸煙史14 y；體查可發現左側肢體上運動神經元損害(左側肢體肌力4級、肌張力增高、腱反射活躍，病理征陽性)及高級神經活動-短時及長時記憶均有輕度下降，MMSE評分為28/30(定向力、注意力及計算力、語言能力均正常)。患者家系分析：患者母親(已死亡)約40歲時開始出現偏頭痛、反復出現腦缺血發作及進行性記憶力下降；患者姐姐現41歲，38歲開始出現偏頭痛及進行性記憶力下降，未出現腦缺血發作；其他親屬未出現偏頭痛、腦缺血發作及認知功能減退(見圖1)。

血常規、肝腎功能、電解質、血糖、血脂及同型半胱氨酸均未見異常，自身免疫指標包括ANA、抗-dsDNA、ANCA、抗心磷脂組合、狼瘡抗體等均陰性；頭部MRI示：雙側基底節、放射冠、左側丘腦、延髓右側多發新舊不同的梗死灶，皮質下白質廣泛對側性信號異常，符合CADASIL的頭部影像學改變(見圖2)。對CADASIL病NOTCH3基因突變熱區(3-6/11-14/18-19)進行測序，結果顯示：NOTCH3 c.331G>T 3號外顯子 p.(Gly111Cys)雜合；非 SNP(見圖3)。NOTCH3基因相關的數據庫，HGMD數據庫(Human Gene Mutation Database)顯示到2015年3月份更新的數據為止，沒有查到c.331G>T突變的報道，最相近的是c.328的報道(見圖4)。

圖1 該CADASIL患者的家系圖譜：箭頭代表先證者，正方形代表男性，圓形代表女性

圖2 頭部MRI T2像及Flair示:雙側顳極、皮質下白質廣泛對稱性高信號，符合CADASIL影像學改變

圖3 CADASIL致病基因NOTCH3突變熱區(3-6/11-14/18-19)測序發現-NOTCH3 c.331G>T 3號外顯子

圖4 NOTCH3的基因相關的數據庫，HGMD數據庫(Human Gene Mutation Database)顯示到2015年3月份更新的數據為止，沒有查到c.331G>T突變的報道，最相近的是c.328的報道

2 討 論

CADASIL臨床癥狀存在多樣性，在不同的家系臨床癥狀常常不同，可能是由于不同的致病突變引起[3]，即使在同一個家系，不同的家系成員臨床癥狀也有不同，具體原因不清。部分患者存在基因突變且MRI上存在明顯的病灶卻沒有任何癥狀[4,5]，然而有的患者只表現為一種典型的臨床癥狀,例如先兆偏頭痛、腦缺血發作或認知功能障礙[6,7]。約1/4的患者會出現偏頭痛，常常在20～40歲期間起病；腦缺血發作在60%～80%的患者出現，一般會出現2～3次的急性發作，起病年齡主要集中在30～50歲之間；認知功能障礙是進行性進展，60～70歲左右可能進展為癡呆；情感障礙主要是抑郁，發病率約占CADASIL患者的10%～20%，在任何年齡都會發病，主要集中在40～50歲。

CADASIL的影像有相應的特點，MRI T2像與Flair常常出現對稱性腦白質高信號，尤以顳極及外囊明顯，出現類似影像學改變還需與其他疾病鑒別例如伴皮質下梗死和白質腦病的常染色體隱性遺傳性腦動脈病(cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CARASIL)、多發性硬化(multiple sclerosis,MS)、皮質下動脈硬化性腦病(Binswanger病)等。CARASIL與CADASIL的臨床癥狀和影像學十分相似，鑒別兩者的主要方法是基因診斷及皮膚活檢，基因檢測是金標準，CADASIL突變基因是NOTCH3基因，而CARASIL突變基因是HTRA1基因，而皮膚活檢檢測是否有GOM沉積也是協助區分CARASIL與CADASIL的重要方法；MS常常累及脊髓與視神經，頭部影像學很少出現對稱性顳極病灶，而以垂直于側腦室的散在病灶常見，腦脊液寡克隆帶陽性也可協助診斷；Binswanger病常常有高血壓病史，影像學可見腦室周圍白質彌散性損害，一般沒有顳極對稱性損害。

該患者分別于31歲及37歲出現過兩次急性卒中，目前開始出現輕度記憶力下降，從未出現偏頭痛，家系分析證實患者母親及姐姐都出現了偏頭痛及記憶力下降的臨床表現，母親還存在反復腦缺血發作，影像學MRI T2像及Flair的改變符合CADASIL影像學特點，結合患者臨床表現及影像學改變提示CADASIL的診斷。

CADASIL的確診是非常復雜的，組織病理學特點主要是腦白質區域微小動脈管壁增厚、內膜PAS陽性染色、微小動脈GOM沉積，由于無法對患者深部腦白質進行活檢，所以通過腦組織活檢來確診CADASIL是極其困難的；CADASIL是系統性改變，通過皮膚活檢檢測微小動脈GOM沉積可以作為一種輔助診斷方法，然而皮膚微小動脈GOM沉積對于診斷CADASIL特異性很高但并不十分敏感[8,9]，所以皮膚活檢也存在相應的局限性。

當基因檢測發現一個新的突變，判斷是否為CADASIL的致病突變對于確診CADASIL是極其重要的；大部分的NOTCH3基因突變都是錯義突變，錯義突變導致半胱氨酸殘基數量不配對從而引起N3ECD結構改變及毒性增加被認為是CADASIL經典的致病機制，但是其他類型例如基因內小缺失、復制及接合部位的突變都曾報道過，其中缺失有時不會引起半胱氨酸殘基數量的改變,而是通過改變半胱氨酸殘基之間的距離從而影響二硫鍵形成而致病。同時也有報道沒有引起半胱氨酸數量改變的錯義突變依然可認為是致病突變，已經發現p.Ala1020Pro,p.Arg213Lys,p.Tyr1098Ser and p.Arg75Pro的改變通過皮膚活檢協診為CADASIL，它們的氨基酸替換并沒有涉及半胱氨酸，所以沒有非常充分的證據表示不涉及半胱氨酸的錯義突變和CADASIL發病無關[10～13]。目前有超過230種不同的致病突變報道，致病突變常常在外顯子2-24號，2-24號外顯子主要編碼EGFr，2-24號外顯子又以3號和4號外顯子的突變最為常見；突變的外顯子因國家不同流行程度也有所不同，在法國、德國及英國，最常見的是4號外顯子，其次是3號外顯子[14～16]，然而在荷蘭，CADASIL致病外顯子最常見的是4號外顯子，其次卻是11號外顯子[17]；在中國大陸，NOTCH3突變位點主要集中在4號外顯子及3號外顯子，Liu等對中國大陸57個家族62個患者進行基因分析發現突變位點大部分集中在4號外顯子59.6%(34/57)及3號外顯子22.8%(13/57)，其中堿基替換以4號外顯子c.505C>T(9/57)最常見，其次是c.544C>T(7/57)[18]。然而在中華臺北突變主要集中在11號外顯子，Liao等對中華臺北95個家族112個患者進行基因測序得到20個不同的基因突變且都是錯義突變導致的半胱氨酸不配對，在11號外顯子(c.1630C>T)是最常見的突變，占70.5%(67/95)，少于1/5的突變集中在3-6號外顯子[19]。

該患者基因檢測結果顯示NOTCH3基因331位(位于3號外顯子)T替換了G，從而導致翻譯蛋白第11位氨基酸殘基由甘氨酸(Gly)變成了半胱氨酸(Cys)，雖然這種突變為首次報道，是一個新的基因突變，但NOTCH3基因331位是位于3號外顯子，而3號外顯子是突變最為常見的部位之一，重要的是該突變引起甘氨酸變成半胱氨酸，增加了一個半胱氨酸，NOTCH3基因突變造成半胱氨酸數量的不配對是CADASIL經典的致病機制，故認為此基因突變為CADASIL致病突變。

3 結 論

雖然這個新的基因突變-NOTCH3基因331位(位于3號外顯子)T替換了G導致翻譯蛋白中第11位氨基酸殘基由甘氨酸(Gly)變成了半胱氨酸(Cys)未曾有過報道，但是這個突變位點位于CADASIL致病基因NOTCH3突變熱區，且該突變導致的半胱氨酸數量不配對是符合CADASIL普遍認可的致病機制，同時結合患者臨床表現、影像學及家系分析均支持該新的基因突變是CADASIL的致病突變。

這個新的致病基因的發現同時說明基因檢測對于CADASIL的診斷及尋找新的致病基因是非常有效的工具，基因檢測的發展將對我們了解CADASIL及未來治療CADASIL起著關鍵的作用。

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Sequence analysis of the NOTCH3 gene discover a novel pathogenic mutation:complexity in the diagnosis of CADASIL

LIN Jing,JI Xiaotan,WANG Dilong,et al.

(Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510080,China)

Objective To emphasis the the importance of genetic tests and the complexity in the diagnosis of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) by discovering a novel mutation.Methods Analyze clinical manifestation,laboratory examination,imaging examination,pedigree investigation and genetic tests of a patient suspected CADASIL.The clinical manifestation included recurrent ischemic stroke and progressive memory loss.Laboratory tests excluded hypercoagulable disorders and vasculitides.Magnetic resonance imaging (MRI) of the patient’s brain revealed symmetric and extensive abnormal signal in the subcortical white matter and novel or old infarction lesions.The family member of the patient had the history of migraine,recurrent stroke and memory loss.Sequence analysis of hot point mutations of the NOTCH3 gene,unveiled a novel mutation,c.331G>T (p.Gly111Cys 3 exon),which have not detected in Human Gene Mutation Database up to now.Results Combined with the characteristics of clinical manifestation,imaging of brain,family history and genetic sequence,the patient was identified as CADASIL and the novel mutation had been considered as the pathogenic mutation of CADASIL.Conclusion The fingding of the novel pathogenic gene emphasize the significance of genetic tests and the cognition in pathogenesis of mutation gene.

CADASIL； NOTCH3； Novel mutation； Genetic sequence； Exon

1003-2754(2016)06-0492-04

2016-02-09；

2016-03-29

廣東省省科技計劃項目(2015A030302013)

(中山大學附屬第一醫院神經科，廣東 廣州 510080)

范玉華，E-mail：fansusan@126.com

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