Ophiognomonia castaneae協同板栗褐緣葉枯病病原菌致病作用的研究

馬洪兵+劉國興+龔賽+張秀停+王慶華+姜淑霞

摘要：為明確板栗新病害褐緣葉枯病病原菌Phomopsis castaneae-mollissimae（Y1）與其共生菌板栗蛇孢日規殼Ophiognomonia castaneae（Y6）的關系，采用在發病不同時期組織分離、定期采樣觀察、致病性測定及對峙培養等方法進行研究。結果表明，發病初期在褐緣葉枯病病健交界處只分離到Y1，隨病斑擴展Y6的分離頻率逐漸增加，發病后期Y6的分離頻率略高于Y1；Y6的無性型和有性型子實體均生長在病斑上；離體葉片接種Y1易產生病斑，接種Y6很少產生病斑，兩菌混合接種比單獨接種產生的病斑癥狀明顯且發病速度快，表現出Y1致病力強，Y6致病力弱，Y6具有協同Y1致病的作用；Y6和Y1的營養體表現出明顯的完全的親和力。

關鍵詞：Ophiognomonia castaneae；板栗褐緣葉枯病；協同致病

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0109-05

Abstract The methods such as tissue isolation in different stages， regular sampling observation， pathogenicity identification and confronting incubation were adopted to find out the relation between Phomopsis castaneae-mollissimae（Y1）， the pathogeny of a new chestnut disease brown margin leaf blight，and Ophiognomonia castaneae （Y6） ， a symbiotic bacteria of Y1. The results showed that at the early stage of brown margin leaf blight， only Y1 was isolated at the junction of diseased and healthy tissue. Along with the extension of lesion spots， the isolation frequency of Y6 increased gradually. At the late stage， the isolation frequency of Y6 exceeded that of Y1 slightly. The anamorph and teleomorph fruit bodies of Y6 both occurred in the lesion spots. Inoculating the 2 fungi to detached leaves respectively， Y1 produced lesion spots easily and Y6 rarely. However， the lesion spot symptom occurred more obviously and the disease developing speed was faster when the detached leaves were inoculated by Y6 combined with Y1 than that inoculated by Y1 or Y6 solo. It showed that Y1 owned the powerful pathogenicity， while Y6 owned the weak pathogenicity， and Y6 and Y1 had the coordinated pathogenic effect. The vegetative body of Y6 and Y1 had the obvious and complete compatibility.

Keywords Ophiognomonia castaneae；Phomopsis castaneae-mollissimae；Coordinated pathogenic effect

板栗褐緣葉枯病是近幾年在我國板栗產區新發生的一種嚴重的葉部病害，其病原菌為板栗擬莖點霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae（代號Y1，下同）[1-3]。在對板栗褐緣葉枯病病原菌分離的過程中發現，病斑上著生著另一真菌——Ophiognomonia castaneae（代號Y6，下同），該菌在病健交界處分離到的頻率僅次于致病菌，且發病部位產生大量Y6的無性子實體（分生孢子盤），很容易被誤認作褐緣葉枯病病原菌。產生Y6子實體的病斑癥狀、病斑大小與褐緣葉枯病病斑并無明顯區別，交叉混雜在一起，且二者發生的時間較為一致，但將Y6單獨在室內和林間接種，并不產生板栗褐緣葉枯病的癥狀。

真菌對營養的需求不同或不同生長階段對營養的需求不同，造成了部分病原菌活動及致病機理的復雜性。根據科赫假定的原則，一種病害的致病菌只有一種，但現今的科學研究表明，有些病害的致病菌并非是單一病原菌[4，5]，同一屬內不同種類的真菌交互致病的現象較為常見，不同科屬真菌協同侵染的研究報道卻較少。本試驗研究了Y6和Y1對寄主的侵染關系，以期為板栗褐緣葉枯病的發病規律、預防和治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

板栗褐緣葉枯病病害標本采自山東省泰安市徂徠山林場光華寺林區。經組織分離、純化培養得到Y1和Y6菌株，4℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同時期Y6與Y1分離頻率 于2012、2013年7月下旬-10月中旬采集帶病斑的葉片，在病健交界處切2 mm葉片組織，經沖洗、消毒，斜插到PDA平板培養基上，置于25℃培養箱培養。每次分離100個點，根據菌落形態差異，統計48 h分離到的兩種菌在總分離物中的比例。

1.2.2 Y6子實體著生位置與板栗褐緣葉枯病病斑的關系 于2012年和2013年9-12月在林間采集病葉，體視鏡下觀察Y6無性型分生孢子盤在病葉上的分布特點，次年5-6月采集發病區上年落葉，觀察有性型子囊殼的分布特點。

1.2.3 Y6 和Y1致病性測定 采用離體葉片接種法。于2013年8-9月份采集新鮮無病斑葉片，在 15 cm培養皿中鋪6層滅菌紗布，無菌水浸濕。將一葉片放入皿中，用消毒昆蟲針刺傷葉片，分別接種直徑5 mm 的Y6、Y1及Y6和Y1各1/2的合并菌餅。每葉接4個點，2片葉為一組，對照組接空白培養基。置于晝30℃14 h、夜25℃10 h人工氣候箱，濕度80%，48 h后去除菌餅。于接種后7、14 d觀察病斑產生情況。

1.2.4 Y6與Y1的營養體親和性 在PDA平板培養基上，一側接種Y6菌餅，25℃下培養7 d后，再在另一側接種Y1菌餅，菌餅間距1.5 cm，設5個重復。25℃條件下培養，10 d后觀察對峙培養結果。

2 結果與分析

2.1 不同時期分離Y6與Y1的頻率

Y6與Y1兩菌落形態有明顯差異。Y6菌落形態具多樣性，多表現為菌落較厚，氈狀，邊沿形狀不規則，氣生菌絲稀疏白色，生長緩慢（4周左右菌落直徑3～4 cm），初分離得到的菌落易產生淺黃色、半固體粘稠的多糖類分泌物。Y1菌落的分離物先產生一層無色、透明、濕潤的基生菌絲， 3～4 d后長出濃密氣生菌絲，菌絲白色，生長速度快，后期為淡灰色或褐灰色，多數在平板易產生 3～4個界限明顯的環痕[1]。不同時期Y6與Y1的分離頻率見表1。

7月下旬，病區少量葉片正面初見小病斑，病健交界處組織分離培養，分離到大量Y1；8月上旬，病斑面積開始擴展，病健交界處Y6和Y1的分離頻率為5.7%和75.8%，Y1的數量占絕對優勢，但在病健交界處至病斑中心Y6分離頻率可達高到50%以上（多數為Y1和Y6的混合菌絲）；8月中旬病斑數量明顯增長，病害進入快速增長期；8月下旬至9中、下旬病害進入發病高峰，病斑面積和數量都在不斷擴大，部分感病嚴重的葉片病斑開始連接成片，發病部位焦枯，Y6菌株的分離頻率逐漸增加；10月中旬，Y6菌株的分離頻率超過Y1，且時間越晚Y6菌株的分離頻率越大。

2.2 Y6子實體著生位置與板栗褐緣葉枯病病斑的關系

10月底開始，板栗病葉落葉前焦枯的葉片及落葉后干枯的葉片，其葉背面沿病斑邊沿分布一圈密集深褐色的圓形小點，即Y6分生孢子盤，初期只著生在病斑邊沿，形成環形，后期病斑中部也開始形成，隨后所有病斑上均可見到Y6無性型子實體。病斑邊沿處分生孢子盤較大，飽滿，密集分布，環形明顯；病斑內分生孢子盤相對稀疏，較小，分布較均勻。非病斑處及葉正面病斑處未發現分生孢子盤，如圖1A 。

病葉脫落后，最早在當年11月下旬，濕度較大或有水浸濕的葉片背面病斑處長出Y6未成熟子囊殼，至次年5～6月，子囊殼大量產生，從成熟子囊殼頂端生長出黑色長喙，密集分布在葉背面病斑上，其在葉片上的分布規律相似于無性型子實體，如圖1B。

2.3 Y6 和Y1的致病性

8月份致病性測定結果表明，接種Y6菌7 d后，大多不產生病斑，偶爾有很小的（<0.1 cm）病斑產生，14 d后致病率14.1%，病斑一般小于0.2 cm；接種Y1菌7 d后，大多接種點產生小于1 cm病斑，14 d后致病率81.3%，但病斑擴展較小，多在1 cm左右；同時接種Y6和Y1兩菌7 d后，接種點大多產生大于1 cm的病斑，14 d后全部接種點都產生病斑，病斑直徑一般2～3 cm。CK組14 d后仍不產生病斑（見圖2、表2）。

9月份致病性測定表明，接種Y6菌與8月份致病結果近似，但14 d后，致病率提高到26.6%；接種Y1菌7 d后，接種點大部產生病斑，病斑迅速擴展，形成2～3 cm不規則病斑，少數接種點病斑連接成片至整個葉片，14 d后，病斑擴展至全葉并焦枯；接種Y6和Y1合并菌7 d后， 接種點產生較大病斑，且多連接成片，病斑處葉片開始焦枯，14 d后，病斑擴展至整片葉，并產生嚴重的焦枯現象；CK組14 d后仍不產生病斑（見表2）。

2.4 Y6與Y1營養體親和性

結果顯示，接種后Y1菌絲迅速生長到Y6菌絲邊沿，后出現短暫的停滯現象，菌絲整齊，后迅速覆蓋到Y6菌落上。菌落交界處均表現為菌絲變致密，無色素產生，形成一條由致密的氣生菌絲集結的隆起帶，隆起帶偏于菌落生長較慢的Y6菌落一側，如圖3所示。表明，Y6與Y1的營養體表現出完全的親和性，這與兩菌在板栗褐緣葉枯病上共同侵染、形成混合病斑的現象是一致的。

3 討論與結論

不同時期Y6與Y1的分離頻率表明，前期病健交界處以Y1為主，其分離頻率呈現先增長后減少的趨勢，Y1先侵染使葉片產生病斑，當葉片病斑擴展至2～3 mm時，在病斑中心可分離到Y6。病害發生的中、后期Y6的比例逐漸增大，最終在數量上超過Y1，成為病健交界處的優勢菌株。Y6的有性型和無性型子實體均生長在Y1引起的病斑上，而在無Y1病斑的葉片上未發現有Y6子實體。可以推斷：①Y1具有強的致病性和寄生性，Y6具有弱的致病性和較強的腐生性；② Y6需要在Y1侵染形成的病斑上產生繁殖結構繁衍后代；③ Y6通過增強Y1致病力與Y1協同致病，通過加強對葉片的危害來擴大其棲息場所從而更好地生長和繁衍。

8月份和9月份兩次致病性測定結果有一定差異，分析認為，8月份板栗葉片生長旺盛，營養較為豐富，抗性較強，而此時自然界病原菌剛侵染葉片產生病斑，因此對葉片接種產生病斑較小，擴展較慢，葉片不易焦枯。9月份板栗樹處于生殖生長后期，葉部營養物質減少，抗病力降低，易受病菌侵染而發病。離體葉片接種結果表明，Y1菌致病力強，病斑產生快，Y6致病力很弱，二者同時接種致病力大于單獨接種Y1菌，表現出協同侵染的特點。Y6與Y1菌株的營養體親和性強，間接證明二者可以融合生長在一起。有關協同致病、協同侵染或復合侵染的報道多見于真菌與昆蟲[6]、真菌與線蟲[7，8]、病毒與病毒[9-11]之間，而真菌與真菌的相關報道較少。2種及其以上病原物侵染寄主的方式有相繼協同作用（sequential synergism）和相伴協同作用（concomitant synergism）兩種[12]，初步斷定Y6與Y1的關系屬于前者，侵染過程中Y1承擔著初始病原（primary pathogens）的角色，而Y6則扮演了繼入病原（secondary pathogens）的角色，但是兩菌的協同侵染機制和過程等還需要進一步探索。

參 考 文 獻：

[1] 姜淑霞， 馬洪兵. 板栗上的擬莖點霉一新種[J]. 菌物學報， 2010， 29（4）： 467-471.

[2] 姜淑霞， 劉傳忠， 王慶華， 等. 板栗新病害褐緣葉枯病及病原鑒定[J].林業科學， 2011， 47（5）： 177-180.

[3] 姜淑霞， 賈雯， 邵云華， 等. 板栗褐緣葉枯病病原菌生物學特性研究[J]. 山東農業科學， 2010 （4）： 52-55.

[4] 曹茂開，汪美先. 科赫氏法則在現代醫學中的新思考[J]. 醫學與哲學（人文社會醫學版），1991（12）：8-10.

[5] 喻盛甫，胡先奇，王揚. 包含病原線蟲的植物復合侵染病害[J]. 植物病理學報，1999，29（1）：1-7.

[6] 宋立秋，魏利民，王振營，等. 亞洲玉米螟與串珠鐮孢菌復合侵染對玉米產量損失的影響[J]. 植物保護學報，2009，36（6）：487-490.

[7] Smith A L. The reaction of cotton varieties to Fusarium wilt and root-knot nematode[J]. Phytopathology， 1941，31：1099-1107.

[8] Porter D M， Powell N T. Influence of certain Meloidogyne species on Fusarium wilt development in flue-cured tobacco[J]. Phytopathology， 1967，57：282-285.

[9] 方琦，董家紅，鄭寬瑜，等. 番茄環紋斑點病毒與馬鈴薯Y病毒復合侵染煙草的細胞病理特征[J]. 植物學報，2014，49（6）：704-709.

[10]青玲，牛顏冰，吳楚釗，等. 部分煙區煙草病毒病病原檢測及復合侵染分析[J]. 煙草科技，2009（12）：58-64.

[11]謝禮，呂明芳，王芳，等. 甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯褪綠矮化病毒復合侵染甘薯引起的細胞病理學研究[J]. 電子顯微學報，2013，32（6）：485-491.

[12]Powell N T. Internal synergisms among organisms inducing disease[J]. Plant Disease， 1979，4：112-133.