一株高效解磷菌的篩選、鑒定及解磷特性研究

劉露+李麗+閆洪雪

摘要：從黃島區鹽堿地采集土壤樣品，分離和篩選高效解磷菌，并進行鑒定，在此基礎上，研究了其對鹽堿地的改良作用。結果表明，從鹽堿地中分離到6株解磷菌，其中PC02解磷能力最高，有效磷含量為80.3 mg/L；結合其形態特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系統發育樹分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；解磷菌PC02具有降低鹽堿地pH值和提高土壤有效磷含量的作用。

關鍵詞：鹽堿地；解磷菌；巨大芽孢桿菌

中圖分類號：S154.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0069-04

Abstract The soil sample of saline-alkali land in Huangdao was collected to isolate and screen high phosphate-solubilizing bacteria， then the screened strain was identified and its improving effects on saline-alkali land were determined. The results showed that six phosphate-solubilizing bacterial strains were isolated， among which， PC02 had the highest phosphate-solubilizing capacity with the available phosphorus content of 80.3 mg/L. Combined with the analyses of morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and phylogenetic tree， PC02 was identified as Bacillus megaterium. It had the functions of reducing pH value and improving available phosphorus content of saline-alkali land.

Keywords Saline-alkali land； Phosphate-solubilizing bacterium； Bacillus megaterium

土壤鹽堿化是一個世界性問題。據估計，全球鹽堿地每年以100萬～150萬 hm2的速度增長[1]。鹽堿地占全球總陸地面積的10%[2]，我國是土壤鹽堿化最為嚴重的國家之一。鹽堿地治理是一項長期持久的工作，最本質的是從根本上改良鹽堿地。磷是植物生長發育必需的營養元素，在農業生產中可直接影響作物產量。植物吸收的磷主要來自土壤，而鹽堿地中pH較高，95%以上的磷很難被植物直接吸收利用，為無效態磷[3]。另外，作物對施入的磷肥當季利用率只有5%～10%[4]，大部分磷積累在土壤中，因此提高鹽堿地中磷的利用率具有非常重要的意義。

解磷菌是一種可將土壤中難溶性磷轉化為植物可以吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群[5]，在轉化土壤難溶性磷和提高磷肥利用率方面具有非常重要的作用[6]。解磷菌成為研究熱點。然而對解磷菌的研究多在對一些作物生長的影響上，未見對鹽堿地改良效果的相關研究。本文針對鹽堿地問題篩選并鑒定了一株高效解磷菌，并初步試驗了其對鹽堿地的改良效果，以期為鹽堿地改良提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 土樣：采自青島黃島區鹽堿地。

1.1.2 培養基 富集培養基：葡萄糖10 g，磷酸三鈣 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，酵母粉 0.5 g，水1 L，pH 7.0。

初篩培養基：富集培養基中加入瓊脂粉20 g。

PVK培養基：初篩培養基加入0.4%溴酚藍（pH 6.7）6 mL。

復篩培養基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，磷酸三鈣 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，水1 L，pH 7.0。

發酵培養基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，MnSO4 0.02 g，水1 L，pH 7.0。

生理生化鑒定培養基：依據《常見細菌系統鑒定手冊》[7]配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌的分離和篩選 取10 g采集土樣置于100 mL無菌水搖瓶中，32℃振蕩30 min；取5 mL原液加到以磷酸三鈣為唯一磷源的50 mL富集培養基中，32℃培養72 h；取5 mL富集液轉移到另一新鮮的富集培養基中，連續轉接3次。

將最后的富集液稀釋105倍，取稀釋的懸液0.1 mL涂布初篩培養基，32℃培養。待平板長出菌落，挑取單菌落，在另一個平板上劃線純化，多次劃線后用顯微鏡檢查菌落是否單一，直至獲得純培養物后斜面保存備用。

1.2.2 高效解磷優良菌株的篩選 將篩選到的菌株接種到PVK培養基上，32℃培養48 h，觀察透明圈大小。選擇透明圈較大的菌株進行下一步試驗。

按照文獻[8]檢測有效磷含量。將篩選到的菌株接種到復篩培養基上，32℃培養4 d，12 000 r/min離心10 min，取上清液按照文獻方法檢測有效磷含量。

1.2.3 高效解磷優良菌株的鑒定 ① 形態學特征與生理生化特征鑒定。將篩選到的高效解磷優良菌株涂布于初篩培養基平板上，32℃培養48 h，觀察細胞形態和菌落特征，部分生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]。

② 16S rDNA鑒定。基因組總DNA提取后，利用正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′進行16S rDNA全序列擴增，PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增效果。將克隆后的樣品送至華大基因進行測序。

將所得序列在NCBI上進行BLAST分析比對，并選取相關菌株，利用MEGA 5.0軟件采用Neighbor Joining法構建系統進化樹。

1.2.4 高效解磷優良菌株的解磷特性研究 將篩選到的高效解磷優良菌株接種到發酵培養基中，搖床培養至完全轉芽孢。以黃島區鹽堿地為試驗對象，將該菌株發酵液施入鹽堿地，以不施發酵液的鹽堿地為對照，比較pH值、有效磷含量。pH值測定采用電位測定法，有效磷含量測定同1.2.2。

2 結果與分析

2.1 高效解磷菌株的分離篩選

本研究從黃島區鹽堿地中通過富集和初篩分離到18株細菌，在PVK培養基上生長、可產生透明圈的有6株，編號分別為PA03、PB01、PB03、PC02、PC05和PF03。這6株菌能在以磷酸三鈣為唯一磷源的培養基上生長，并能在PVK培養基上產生透明圈，說明這6株菌具有解磷效果。

將篩選到的6株細菌接種到復篩培養基，32℃培養4 d，所得上清液的有效磷含量如表1所示。可見，菌株PC02發酵液內有效磷含量明顯高于其他菌株，因此將其作為下一步的研究菌株。

2.2 高效解磷菌株PC02的鑒定

2.2.1 形態特征 菌株PC02在初篩平板上培養48 h后，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，隆起，濕潤，邊緣整齊；桿狀，有芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。

2.2.2 生理生化特性 菌株PC02的生理生化結果如表2所示。可見，該菌株與巨大芽孢桿菌的生理生化特征相同，結合形態特征，該菌株初步鑒定為巨大芽孢桿菌。

2.2.3 16S rDNA基因序列及系統發育樹分析 測序得到菌株PC02的16S rDNA基因序列，1 404 bp。構建系統發育樹，如圖1所示，菌株PC02與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）親緣關系最近，確定該菌株為巨大芽孢桿菌。

2.3 高效解磷菌株PC02發酵液對鹽堿地的改良作用

在PC02發酵液施入鹽堿地前，對照組和試驗組pH值均為8.12，有效磷含量為8 mg/kg，總磷含量0.12%。施入3個月后，對照組pH值、有效磷含量和總磷含量無明顯變化，試驗組pH 值7.76，有效磷含量 11 mg/kg，總磷含量0.12%。通過施入PC02發酵液，土壤pH值明顯降低，總磷不變的情況下有效磷含量明顯提高，可見巨大芽孢桿菌對鹽堿地有一定的改良作用。

3 討論與結論

本研究從黃島區鹽堿地中分離出6株解磷菌，通過對有效磷的定量檢測，篩選到一株解磷能力強的菌株PC02。結合其形態特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系統發育樹分析將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。通過鹽堿地改良試驗，證明了解磷菌PC02可降低土壤pH和提高土壤有效磷含量。

本研究篩選到的解磷菌PC02解磷能力較強，但與李鳴曉[10]、李振東[11]等篩選到的菌株解磷能力還有一定差距，可以通過菌株馴化、誘變育種或培養基及發酵條件的優化來提高菌株的解磷能力。植物對有效磷的吸收利用是一個較復雜的過程，菌株轉化的有效磷對植物生長的作用有待進一步研究。

參 考 文 獻：

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