參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性及耳蝸Caspase-3表達的影響

張 博, 陳 穎, 黃 喜, 程勝男, 李海燕, 王 娜

(1. 湖北科技學院 耳鼻咽喉教研室, 咸寧市中心醫院 耳鼻喉科, 湖北 咸寧, 437100; 2. 湖北科技學院 10級耳鼻咽喉班, 湖北 咸寧, 437100; 3. 湖北科技學院 耳鼻咽喉教研室, 湖北 咸寧, 437100)

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參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性及耳蝸Caspase-3表達的影響

張 博1, 陳 穎2, 黃 喜2, 程勝男2, 李海燕2, 王 娜3

(1. 湖北科技學院 耳鼻咽喉教研室, 咸寧市中心醫院 耳鼻喉科, 湖北 咸寧, 437100; 2. 湖北科技學院 10級耳鼻咽喉班, 湖北 咸寧, 437100; 3. 湖北科技學院 耳鼻咽喉教研室, 湖北 咸寧, 437100)

目的 探討參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性及耳蝸半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達的影響。方法 將48只同月齡健康成熟小鼠隨機分為對照組、參芎組、順鉑組、實驗組。采用畸變產物耳聲發射(DPOAE)和聽性腦干反應(ABR)方法檢測4組小鼠聽力功能情況，并通過顯微圖像及光密度值對小鼠耳蝸螺旋神經節細胞(SGC)中的Caspase-3表達水平進行研究。結果 在DPOAE檢測中，順鉑組用藥后在0.5 kHz頻度時與對照組相比無顯著差異，但在1、3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較對照組有顯著下降(P<0.05); 實驗組用藥后在0.5、1 kHz頻度時與順鉑組相比無顯著差異，但在3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較順鉑組有顯著增高(P<0.05)。在ABR檢測中，順鉑組的ABR閾移較對照組有顯著提高(P<0.05); 實驗組的ABR閾移雖顯著高于對照組(P<0.05), 但ABR閾移卻顯著低于順鉑組(P<0.05)。順鉑組小鼠的耳蝸SGC可見明顯Caspase-3陽性染色，棕黃色顆粒彌散分布在其SGC的胞漿內；實驗組小鼠耳蝸SGC 的Caspase-3陽性染色較順鉑組明顯減弱，棕黃色顆粒顯著減少(P<0.05); 實驗組Caspase-3表達的光密度值顯著低于順鉑組(P<0.05)。結論 參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性具有一定的防護作用，可用于減輕順鉑耳毒性。

參芎注射液; 順鉑; 耳毒性; Caspase-3

順鉑是目前臨床上應用較為廣泛的抗腫瘤藥物之一，常與其他化療藥物聯合應用，目前較多用于治療肺癌及食管鱗狀細胞癌等[1-3]。但順鉑具有較為嚴重的腎毒性和耳毒性，從而限制其臨床應用[4-6]。參芎葡萄糖注射液為復方制劑，鹽酸川芎嗪和丹參素為其活性成分，具有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、降低血液黏度、加速紅細胞的流速、改善微循環和抗心肌缺血和心肌梗死的作用[7-8]。本研究建立順鉑致耳毒性小鼠模型，通過檢測小鼠的畸變產物耳聲發射(DPOAE)、聽性腦干反應(ABR)及小鼠耳蝸SGC的Caspase-3表達水平，比較參芎葡萄糖注射液對順鉑致小鼠耳毒性的防護作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇同一實驗室同一批次飼養的同月齡健康成熟小白鼠48只(校實驗動物中心提供)，耳廓反射正常，體質量28～32 g, 雌雄不限。小鼠隨機分成4組，即對照組、參芎組、順鉑組、實驗組，每組12只。對照組小鼠平均體質量(29.15±0.35) g; 參芎組小鼠平均體質量(29.11±0.48) g; 順鉑組小鼠平均體質量(28.86±0.42) g; 實驗組小鼠平均體質量(29.07±0.42) g。各組小鼠的年齡、體質量均無顯著差異。將各組小鼠自由飲食，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 給藥方式

對照組給予腹腔注射生理鹽水, 0.25 mL/d, 連續5 d。參芎組給予腹腔注射參芎葡萄糖注射液4 mL/(kg·d)(貴州景峰注射劑有限公司，國藥準字H52020703), 連續5 d。順鉑組給予腹腔注射順鉑4 mg/(kg·d)(齊魯制藥有限公司，國藥準字H37021358), 連續5 d。實驗組在每天注射順鉑前30 min腹腔注射參芎葡萄糖注射液4 mL/(kg·d), 連續給藥5 d。

1.3 DPOAE檢測

將4組小鼠均置于隔音室內，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，采用CAPELLA耳聲發射分析測試系統進行麻醉后小鼠進行DPOAE檢測。選擇初始純音f1和f2，f1/f2=1.22, 強度差L1-L2=10 dB SPL, 以超出本底噪音3 dB為DPOAE檢出標準，測試頻率(f02=f1×f2)作為0.5、1、3、5、8 kHz的幅值。

1.4 ABR閾移檢測

在隔聲室內，分別檢測各組小鼠給藥前和停藥后24 h在8、16、24 kHz三個不同頻度下的ABR閾值。操作方法為先將各組小鼠經1%戊巴比妥鈉按90 mg/kg腹腔注射麻醉，正電極固定于小鼠正中頭皮，負電極固定于小鼠耳廓下的皮下，用短聲作刺激聲，掃描頻率≤3 000 Hz, 掃描疊加次數為500～512次。刺激強度從95 dB SPL開始，以5 dB SPL依次遞減，ABR閾值判定以剛有Ⅰ波為準，由同頻率下的給藥前后的閾值差計算ABR閾移。

1.5 免疫組化標本制備[9]

將4組小鼠測試完DPOAE和ABR后，立即扭斷脊椎致死，并立即摘取聽泡，充分顯露耳蝸，挑破卵圓窗、蝸窗。蝸頂鉆孔，用細玻璃管將4%多聚甲醛從蝸尖至蝸底灌洗數次，并將標本置于該固定液中放入4℃冰箱過夜。依次沖洗，行脫水、透明化、石蠟包埋等處理，以蝸軸為長距，平行連續做3 μm切片樣本。石蠟切片在58℃孵箱中化蠟2 h，常規脫蠟、水化。配置弱酸性(pH 6.0)枸櫞酸鹽緩沖液，然后用緩沖液行熱修復處理，常H2O2孵育10 min, 滴入Caspase-3抗體(1∶100稀釋)，冷藏24 h以上。次日取出切片后，先行PBS沖洗處理，持續清洗4 min, 然后按此方法再清洗2次，再滴入二抗，再次孵育20～30 min, 重復上一步PBS沖洗，再行顯色、染色、脫水、封片等處理；采用生物顯微鏡觀察切片標本。

1.6 Caspase-3表達圖像分析

采用病理圖像分析系統對免疫化切片圖像進行分析，記錄各組小鼠耳蝸SGC的Caspase-3表達陽性的光密度值，得平均光密度值。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般活動情況

對照組小鼠的活動無明顯異常表現；參芎組小鼠的活動也無明顯異常表現；順鉑組小鼠毛發脫落較為嚴重，飲食趨于減少，且反應不夠靈敏；實驗組小鼠較順鉑組小鼠的飲食有所增加，但不規律，時多時少，毛發也無明顯脫落，但較對照組小鼠稀疏，反應能力較順鉑組靈敏。

2.2 各組小鼠的DPOAE檢測

對照組和參芎組相比較, DPOAE幅值無顯著差異(P>0.05); 順鉑組用藥后在0.5 kHz頻度時與對照組相比無顯著差異(P>0.05), 但在1、3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較對照組顯著下降(P<0.05); 實驗組用藥后在0.5、1 kHz頻度時與順鉑組相比無顯著差異(P>0.05), 但在3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較順鉑組有顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠各頻率下DPOAE幅值 dB SPL

與對照組相比較, *P< 0.05; 與順鉑組相比較, #P< 0.05。

2.3 各組小鼠的ABR閾移檢測

用藥后對照組和參芎組的ABR閾移比較無顯著差異(P>0.05); 順鉑組的ABR閾移較對照組有顯著提高(P<0.05); 實驗組的ABR閾移雖顯著高于對照組(P<0.05), 但該組的ABR閾移卻顯著低于順鉑組(P<0.05), 表明參芎注射液對順鉑耳毒小鼠的聽力明顯改善。見表2。

表2 各組小鼠ABR閾移比較 dB SPL

與對照組相比較, *P<0.05; 與順鉑組相比較, #P<0.05。

2.4 各組小鼠耳蝸SGC的Caspase-3表達

對照組和參芎組的小鼠耳蝸SGC的Caspase-3陽性染色不明顯(圖1A、B); 順鉑組小鼠的耳蝸SGC可見明顯Caspase-3陽性染色，其免疫反應產物呈棕黃色顆粒，彌散分布在其SGC的胞漿內(圖1 C); 實驗組小鼠耳蝸SGC的Caspase-3陽性染色較順鉑組明顯減弱，棕黃色顆粒顯著減少(圖1D), 表明順鉑致耳蝸損傷與Caspase-3表達有關，參芎注射液對Caspase-3表達有明顯的改善作用。

2.5 圖像分析結果

對照組和參芎組小鼠用藥后的耳蝸SGC的Caspase-3表達陽性平均光密度無顯著差異(P>0.05); 順鉑組和實驗組小鼠用藥后的耳蝸SGC的Caspase-3表達陽性平均光密度較對照組有顯著差異(P<0.05), 且實驗組小鼠的耳蝸SGC的Caspase-3表達陽性平均光密度較順鉑組有顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠耳蝸SGC的Caspase-3表達量平均光密度比較

與對照組相比較, *P<0.05; 與順鉑組相比較, #P<0.05。

3 討 論

畸變產物耳聲發射(DPOAE)和聽性腦干反應(ABR)為聽力功能檢測的兩個測試方法。DPOAE檢測可以反映耳蝸外毛細胞在不同頻率下的功能，但其也有局限性，不能檢測神經聽覺通路的相關狀態，以致出現一些假陰性診斷；而ABR檢測卻能檢測聽覺神經的相關損傷，所以一般將兩種檢測相互結合使用[10]。本研究中采用DPOAE和ABR方法對各組小鼠的聽力功能進行檢測。在DPOAE檢測中，順鉑組用藥后在0.5 kHz頻度時與對照組相比無顯著差異，但在1、3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較對照組有顯著下降(P<0.05); 實驗組用藥后在0.5、1 kHz頻度時與順鉑組相比無顯著差異，但在3、5、8 kHz頻度的DPOAE幅值較順鉑組有顯著增高(P<0.05), 提示順鉑致耳毒性可能為聽力高頻度損傷。在ABR檢測中，順鉑組的ABR閾移較對照組有顯著提高(P<0.05); 實驗組的ABR閾移雖顯著高于對照組(P<0.05), 但該組的ABR閾移卻顯著低于順鉑組(P<0.05)。兩種方法檢測結果均表明參芎葡萄糖注射液對順鉑致小鼠耳毒性的聽力功能有明顯改善作用。

A. 對照組; B. 參芎組; C. 順鉑組; D. 實驗組

圖1 各組小鼠耳蝸SGC的Caspase-3表達 400倍

近年來不少研究報道順鉑致耳毒性與細胞凋亡途徑密切相關。一方面，由于Caspase的激活又與細胞凋亡途徑有關，而Caspase-3為細胞凋亡中的一種關鍵蛋白酶。本研究中通過免疫化染色顯微圖像及光密度分析發現參芎葡萄糖注射液能夠降低順鉑致小鼠耳蝸中Caspase-3表達，從而改善順鉑對小鼠的耳毒性損傷。另一方面，有研究[11]發現順鉑致耳蝸細胞凋亡與自由基有關，即耳蝸組織與順鉑結合會導致自由基的急劇增加。過多的活性氧自由基會增加脂質過氧化和Ca2+內流，從而導致耳蝸細胞凋亡。參芎葡萄糖注射液由鹽酸川芎嗪和丹參素組成，研究[12-13]報道川芎嗪和丹參素均具有明顯的抗氧化作用。可能正是由于鹽酸川芎嗪和丹參素具有明顯的抗氧化作用，使復方制劑參芎葡萄糖注射液能夠清除自由基，從而降低耳蝸細胞的脂質過氧化、抑制Ca2+內流，起到保護耳蝸細胞的作用，以改善順鉑耳毒性。

綜上所述，參芎葡萄糖注射液能有效降低順鉑致小鼠的耳毒性，減輕聽功能的損傷，抑制耳蝸SGC的Caspase-3表達，因此其對順鉑致耳毒性能起到一定的防護作用。

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Effect of shenxiong injection on cisplatin-induced ototoxicity and Caspase-3 expression in mouse cochlea

ZHANG Bo1，CHEN Ying2，HUANG Xi2，CHENG Shengnan2，LI Haiyan2，WANG Na3

(1.TeachingandResearchSectionofOtolaryngologyofHubeiUniversityofScienceandTechnology,DepartmentofOtolaryngologyofXianningCentralHospital,Xianning,Hubei, 437100; 2.ClassofOtorhinolaryngology,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437100; 3.TeachingandResearchSectionofOtolaryngologyofHubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437100)

Objective To explore the effect of shenxiong injection on cisplatin-induced ototoxicity and Caspase-3 expression in mouse cochlea. Methods A total of 48 adult healthy mice were randomly divided into normal saline control group, shenxiong group, cisplatin group and experimental group. Distortion product otoacoustic emitter (DPOAE) and auditory brainstem response (ABR) method were used for the detection of hearing function in the four groups. Caspase-3 expression of mouse cochlear spiral ganglion cells (SGC) was evaluated by microscopic images and the optical density value. Results In the DPOAE test, there was no significant difference between the cisplatin group and the control group before and after treatment at 0.5 kHz frequency, but the cisplatin group significantly decreased compared with the control group at 1, 3, 5, 8 kHz frequency (P<0.05). There was no significant difference between the experimental group and the cisplatin group before and after treatment at 0.5, 1 kHz frequency, but the experimental group significantly decreased compared with the cisplatin group at 3, 5, 8 kHz frequency (P<0.05). In the ABR test, ABR threshold shift

shenxiong injection; cisplatin; ototoxicity; Caspase-3

2016-08-11

R 595

A

1672-2353(2016)23-001-04

10.7619/jcmp.201623001

of the cisplatin group significantly improved compared with the control group (P<0.05). ABR threshold shift of experimental group was significantly higher than the control group (P<0.05), but ABR threshold shift of experimental group was significantly lower than the cisplatin group (P<0.05). Caspase-3 positive staining was found in the cochlea of mice SGC in the cisplatin group, the brown particles were dispersed in the cytoplasm of SGC. Caspase-3 positive staining in mice cochlear SGC of experimental group was significantly weakened than cisplatin group, brown yellow granules decreased significantly (P<0.05). The optical density value of Caspase-3 expression in experimental group was significantly lower than the cisplatin group (P<0.05). Conclusion Shenxiong injection has a protective effect on ototoxicity induced by cisplatin, and it can reduce the ototoxicity of cisplatin.