表皮生長因子對牙周成纖維細胞增殖的促進作用

萬英明 張玉影 張璐妮 邵 玉 寧明杰 唐 英 姜 暢 齊 玲 于洪泉

(吉林醫藥學院附屬465醫院,吉林 吉林 132013)

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表皮生長因子對牙周成纖維細胞增殖的促進作用

萬英明 張玉影1張璐妮1邵 玉1寧明杰1唐 英1姜 暢1齊 玲1于洪泉2

(吉林醫藥學院附屬465醫院,吉林 吉林 132013)

目的 研究表皮生長因子對人牙周成纖維細胞增殖的作用。方法 原代培養人牙周成纖維細胞，MTT法檢測表皮生長因子作用后牙周成纖維細胞的增殖情況，ELISA法檢測細胞培養上清中細胞周期蛋白cyclinD1的表達。結果 各濃度表皮生長因子均可以促進牙周成纖維細胞的生長，與正常對照組比較，36 h 20 ng/ml 組、72 h 10和20 ng/ml組有統計學差異(P<0.05)；ELISA檢測發現細胞培養上清中cyclinD1的表達增加，20 ng/ml組有統計學差異(P<0.05)。結論 表皮生長因子通過上調細胞周期蛋白cyclinD1的表達而促進牙周成纖維細胞的增殖。

牙周萎縮;表皮生長因子;牙周成纖維細胞;cyclinD1

牙周萎縮出現時對患者可產生不同的影響，如影響美觀、牙痛、牙齒松動、遇冷熱后出現癥狀等，這些都給患者帶來了極大的痛苦。表皮生長因子(EGF)可以促進多種細胞的增殖和抑制細胞凋亡，在組織損傷修復中發揮十分重要的作用〔1～3〕。本研究主要探討EGF對牙周成纖維細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與試劑 人牙周成纖維細胞取自12歲左右因正畸需要拔除的健康前磨牙的齦乳頭組織。DMEM培養液購自美國Hyclone公司，0.25%胰酶和小牛血清購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Thermo公司，四甲基偶氮唑(MTT)購自美國Sigma公司，EGF購自英國PeproTech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養〔4〕取健康12歲左右正畸拔除的前磨牙，置入青、鏈霉素中清洗3次，再用DMEM培養基沖洗3～5次，將牙根周圍組織剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，將組織塊平鋪于10 cm2培養皿中，加入含20%FBS的DMEM培養液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進行培養。從第3日起觀察是否有細胞長出，棄去壞死和污染組織，每3 d換液1次。待細胞長至80%～90%進行傳代培養，第3代后細胞用于后續實驗。

1.2.2 MTT實驗 以每孔8×103個細胞的密度將牙周成纖維細胞均勻接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養過夜。次日加入EGF(濃度分別為0、2.5、5、10、20 ng/ml，基礎培養基為含5%小牛血清的DMEM培養液)，每個濃度設5個復孔，分別作用36和72 h。實驗終止前4 h每孔加入MTT 20 μl繼續孵育，棄上清后每孔加入DMSO 150 μl振蕩溶解，在全自動酶標儀上測定各孔490 nm處的吸光度值。

1.2.3 ELISA實驗 用2.5、5、10、20 ng/ml的EGF處理牙周成纖維細胞72 h，設空白對照組。實驗終止后收集培養上清，與包被液按1∶1比例包被后4℃過夜。封閉1 h，加入cyclin D1抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。次日加入二抗(1∶1 000稀釋)37℃下孵育1.5 h。室溫避光顯色，顏色呈棕黃色變化時終止顯色。自動酶標儀492 nm處測定吸光度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 EGF對牙周成纖維細胞增殖的影響 2.5、5、10和20 ng/ml的EGF在作用牙周成纖維細胞36和72 h均可以促進細胞增殖，與正常對照組比較，36 h時20 ng/ml EGF組有統計學差異(P<0.05)，72 h時10和20 ng/ml EGF組均有統計學差異(P<0.05)。在牙周成纖維細胞中，EGF作用具有明顯的時間-劑量效應。見表1。

2.2 EGF影響牙周成纖維細胞cyclinD1的表達 EGF各濃度組細胞培養上清中cyclinD1蛋白分泌增加，與空白對照組(0.56±0.05)比較，20 ng/ml濃度組(0.76±0.11)有統計學差異(P<0.05)。2.5、5、10 ng/ml組分別為0.58±0.06、0.61±0.03、0.68±0.06。

表1 不同濃度EGF對牙周成纖維細胞增殖的影響±s,n=5)

與0 ng/ml比較:1)P<0.05

3 討 論

牙周萎縮的發生主要由兩種情況引起，一種是生理性萎縮，是由于年齡增長使牙根暴露造成的；另外一種是病理性萎縮，是由于牙周炎癥、長期刷牙方法不當等引起〔5〕。牙周萎縮發生時無特殊有效的治療方法，主要方法是注意口腔衛生及生活習慣、改正不正確的刷牙方法、有較深的楔狀缺損按齲齒及牙髓病治療、牙周外科手術(如側向齦瓣轉移術等)整復〔6〕。但這些方法對于牙周萎縮的治療不能起到根本性的作用。生長因子是一類能促進局部組織細胞生長的生物活性物質〔7〕，EGF作用于細胞后，與細胞表面的表皮生長因子受體EGFR結合，繼而引起EGFR的自身磷酸化，從而啟動下游的多種信號轉導途徑，引起一系列的生物學效應〔8〕。研究表明，EGF可以通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，從而促進輸卵管上皮細胞和舌背黏膜細胞的增殖；也可以促進角膜緣上皮細胞的生長〔9～11〕。EGF還可以通過促進細胞DNA的合成，進而促進視網膜色素上皮細胞的生長〔12〕。EGF單抗也可促進人牙齦上皮細胞的增殖〔13〕。cyclinD1增加可促進細胞的增殖。因此，EGF可能通過增加細胞周期蛋白cyclinD1的表達，從而促進牙周成纖維細胞的增殖，雖然機制還需更多的數據來充實，但這些數據為EGF用于口腔科牙周疾病的治療提供了可行性。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省科技廳國際合作項目(No.20140414049GH)；吉林省衛生廳項目(No.2014Z104)

齊 玲(1974-)，女，副教授，主要從事藥物研發研究。 于洪泉(1974-)，男，副主任醫師，主要從事藥物研發研究。

萬英明(1973-)，女，副主任醫師，主要從事口腔修復和正畸研究。

R787

A

1005-9202(2016)22-5524-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.013

1 吉林醫藥學院病理教研室 2 吉林大學第一醫院神經外科