循環腫瘤細胞的生物學特性及其意義

張凱莉　高小妹(綜述)　欽倫秀1,2,△(審校)

(1復旦大學附屬華山醫院普外科　上?！?00040; 2復旦大學腫瘤轉移研究所　上海　200040; 3復旦大學生物醫學研究院　上?！?00032)

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循環腫瘤細胞的生物學特性及其意義

張凱莉3高小妹3(綜述)欽倫秀1,2,3△(審校)

(1復旦大學附屬華山醫院普外科上海200040;2復旦大學腫瘤轉移研究所上海200040;3復旦大學生物醫學研究院上海200032)

【摘要】循環腫瘤細胞 (circulating tumor cells,CTCs)是導致腫瘤發生遠處轉移的重要因素。近10年隨著CTCs檢測技術的進步,發現CTCs的數目與患者預后密切相關;根據CTCs的生物學特性進行亞群分型能夠更合理地指導個體化治療方案的選擇。

【關鍵詞】循環腫瘤細胞;腫瘤轉移;腫瘤治療

腫瘤細胞的播散是腫瘤發展進程中的重要特征[1],腫瘤細胞從原發病灶脫落,浸潤基底膜,穿過血管壁進入血液循環形成循環腫瘤細胞 (circulating tumor cells,CTCs),隨著血液循環到達并定植在遠端器官或重新定植到原發病灶,導致原位復發和遠端器官轉移病灶的形成[2-3]。早在1869年Thomas Ashworth首次發現腫瘤患者外周血中存在CTCs[4]。CTCs作為轉移病灶的種子前體,在腫瘤轉移過程中扮演了十分重要的作用。近10年,由于其分離和鑒定技術的發展,CTCs再次成為腫瘤轉移研究領域的熱點。2015年至今關于CTCs的研究平均以每周25篇的速度呈現在PubMed,同時ClinicalTrials.gov上顯示近720項以CTCs作為腫瘤生物學標記物的臨床試驗。越來越多的研究結果表明CTCs數目和其生物學特性與腫瘤轉移緊密相關,且具有極為重要的臨床指導意義。本文就CTCs的富集分離檢測技術、生物學特征及潛在的臨床應用這三方面對CTCs的研究現狀作一綜述。

CTCs的富集分離及鑒定的方法

CTCs的富集分離的方法主要基于CTCs不同于血細胞的生物學和物理學的特征。

基于生物學的分離方法在免疫磁珠富集分離方法問世之前,最常用的CTCs檢測方法是基于CTCs表面標記物的流式細胞分選技術 (FACS),然而流式細胞分選技術靈敏度低、假陽性高,成為CTCs后續分析的一大障礙。之后免疫磁珠富集分離法是根據CTCs和血細胞差異表達的蛋白標志物進行陽性富集和陰性富集。首先根據CTCs和血細胞在胚胎發育過程中來源于不同的胚層。CTCs來源內胚層具有上皮樣特性,高表達表皮標志物,如胞質上皮細胞角蛋白家族 (cytokeratins,CKs)和上皮細胞黏附分子 (epithelial cell adhesion molecule,EpCAM),其中EpCAM在CTCs中特異性高表達而在血細胞中不表達,能夠有效地將完整的CTCs從血細胞中分離出來?；谶@一原理將抗EpCAM抗體偶聯到磁珠上,在磁場力的作用下將EpCAM高表達的CTCs從血細胞中分離出來。2004年研發的CellSearch system (Veridex)運用這一原理富集晚期乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者外周血中的CTCs,然后用CK8、CK18、CK19的混合抗體進行熒光染色鑒定,同時對僅在白細胞中高表達的CD45熒光染色,排除白細胞對CTCs判定的干擾。但CellSearch system (Veridex)檢測到CTCs的數量極少,最近基于陽性選擇而研發的MagSweeper[5],IsoFlux[6],VerIFAST[7]這3項技術極大地提高了CTCs的檢測速度和效率。

美國麻省總院Toner教授等聯合CTCs的生物學特性和物理學特性建立一個微流控裝置平臺CTC-chip,如抗原依賴性的免疫磁珠分離的Herringbone-chip[8]。然而,大量的研究證明腫瘤在發生侵襲轉移的過程中會發生上皮間質轉化 (epithelial mesenchymal-transition,EMT),即上皮樣標志物如EpCAM、E-cadherin的下調,N-cadherin的上調。基于EpCAM的富集方法在檢測CTCs可能存在細胞群體的限制,所以還有學者用器官特異性的細胞表面標志物或干細胞標志物來富集CTCs,如在乳腺癌中,除了通用的EpCAM,常用的標記物還有CK19、HER2、ER、PR和MUC1等,前列腺癌的標志物有AR、EGR和PTEN。肝細胞癌的常用標記物有Cytokeratins、EpCAM、ASGPR1、N-cadherin、Vimentin、Gpc3、AFP和albumin等[9]。此外,Toner組根據流體確定的側向位移,慣性聚焦和磁導入研發的CTC-iChip[10],可直接從全血中分離出具有活性的CTCs,回收效率較CellSearch system (Veridex)由1/107顯著提高到1/105。最近,這個研究團隊又研發出用于分離CTCs團簇的的微流控裝置[11]。對于CTCs的富集分離不僅吸引生物學家和物理學家的興趣,同時材料科學家也積極參與CTCs富集分離的研究中。值得一提的是Tseng HR課題組研發的系列NanoVelcro chips,可通過改變反應溫度收集芯片中捕獲的CTCs[12]。

基于物理學的富集分離的方法依據CTCs不同于血細胞的物理特性如細胞大小[13]、密度、形變性[14]及載電量進行富集分離。

Vona等[15]根據HepG2、Hep3B、MCF7、HeLa和LNCaP的大小參數設計了ISET (isolation by size of epithelial tumor cells),可對1 mL全血中的CTCs進行計數,免疫形態學鑒定和分子表征的分析。根據腫瘤細胞與白細胞的密度差異,可進行密度梯度離心法進行分離,主要用試劑盒OncoQuick plus和Ficoll。這兩種方法要求的血量比較大,一般需要15～30 mL,CTC團簇在該方法中可能沉降入紅細胞層而丟失。物理學方法分離獲得的CTCs通常會存在較大的白細胞污染,直接影響對CTCs的分子生物學特性的分析。

富集分離之后的CTCs的鑒定方法主要根據腫瘤細胞基因組的異倍性、轉錄組的特異性及標志性的蛋白質表達進行最終確定。經典的方法集中在染色體的比較基因組雜交 (comparative genomic hybrid,CGH)/DNA或RNA熒光原位雜交 (fluorescenceinsituhybridization,FISH)、實時定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR),以及CTCs在蛋白質水平通過免疫熒光進行亞群的分子分型。目前比較成熟的體外CTC富集檢測系統有CellSearch?system、MagSweeperTM、EPHESIA CTC-chip、CTC-chip、Velcro-like device;體內CTC富集系統有CellCollector?、Photoacoustic和Nanodetector。

CTCs的臨床應用及其潛在應用價值2004年,經美國FDA認證的CellSearch system (Veridex)系統對轉移性乳腺癌[16]、前列腺癌[17]和結直腸癌[18]患者7.5 mL血樣中進行CTCs檢測計數,并與患者預后作相關分析,發現系統治療之前的CTCs可作為預測患者預后的獨立指標。此后,在小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肝癌和肝膽管癌中[19-22],以CellSearch system (Veridex)系統為平臺檢測治療前CTCs數目并分析與患者的預后相關性,進一步證明CTCs可作為腫瘤預測患者預后的獨立指標。同時,對外周血單核細胞通過RT-PCR分析CTCs特異性的EpCAM[23]、Snail[24]的mRNA表達水平發現,EpCAM或Snail的mRNA豐度也可以作為預測肝癌患者預后的獨立指標。同時作為患者預后的生物學標志的血清蛋白標志物和CTCs之間是否具有相關性呢？在前列腺癌中發現,基線CTCs數目與腫瘤大小,常規的血清蛋白質標志物如PSA沒有明顯的相關性[25-26]。在患者體內,CTCs不斷從原發病灶或者是轉移病灶進入血液循環[27],所以CTCs的數目存在時空的異質性。目前,CTCs的數目被認為在治療期間的變化有可能作為評判治療效果的指標。Bidard等[28]開展關于CTCs在轉移性乳腺癌患者臨床應用中的有效性的多中心研究再次證實治療前CTCs大于5的患者比小于5的患者具有更短的無進展生存期和總體生存期,開展治療后,對患者CTCs實時監測,相較于治療前的CTCs數目,在3～5周時CTCs數目增加的患者比6～8周CTCs數目增加的患者的預后要差,而同一時間點癌胚抗原和腫瘤抗原濃度變化與患者臨床預后的相關性不如CTCs數目的變化理想。綜上,CTCs數目的多少及其在治療中數目的k變化可用于判斷患者的預后生存情況和治療方案的有效性,但CTCs數目并不能精準地指導治療方案的選擇,故在CTCs計數的臨床意義研究之后,科學家將研究方向轉向CTCs的生物學特性研究。

CTCs的生物學特性研究在CTC富集分離的技術日漸成熟后,隨著單細胞研究技術的不斷革新,關于CTC 的研究逐步由探尋某種實體瘤中CTC數目與患者預后的關系以及藥物療效的監測方面轉向CTC的生物學特征與腫瘤轉移。腫瘤細胞離開原發瘤,進入血液循環,成為單個細胞,失去細胞間相互作用而發生失巢凋亡。最近在轉移性乳腺癌中發現抗凋亡蛋白BCL-2在CTCs中高表達,但結果與預期相反,具有高表達BCL-2的CTCs的患者預后好[29],這一現象需要進一步的研究結果來解釋。

現有的研究表明腫瘤具有極大的異質性。在其發生發展過程中,腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤持續生長的主要原因。而EMT與腫瘤轉移緊密相關,科學家大膽猜測并驗證原發瘤來源的CTCs是一個異質性極高的群體,該群體中可能包含不同表型的亞群。不同亞群的CTCs可能具有不同的生物學特征,如EMT樣CTCs、CSCs樣CTCs和轉移起始細胞(metastasis initiate cells,MIC)樣CTCs。器官靶向性轉移的CTCs和耐藥相關CTCs直接與腫瘤轉移及耐藥相關。

2012年,關于胰腺癌的研究發現,在胰腺原位癌形成之前,腫瘤細胞發生EMT進入血液循環,定植在肝臟中,最終形成轉移灶[30],說明EMT在腫瘤轉移過程中發揮重要的作用。對EMT的進一步研究發現,間質型的腫瘤細胞容易進入血管但是不易發生遠端轉移[31-32],大家逐漸認為介于上皮性和間質型的腫瘤細胞可能具有腫瘤干細胞樣的特征[33]。那么,是否可以根據E型或M型標記物來鑒定CTCs亞群呢？2013年Yu等[34]對11個乳腺癌患者CTCs進行檢測,發現很少有細胞同時表達E-M型,在跟蹤一例患者治療過程中CTC表型的動態變化時,發現E-M表型的比例隨著患者疾病狀態發生改變。其中間質型CTCs在患者疾病進展期比例明顯增高,在間質細胞團簇中發現高表達的TGF-β,血小板分泌TGF-β促進腫瘤細胞向間質型轉變,而血小板在腫瘤的著床黏附的過程中發揮重要的作用; 這提示在腫瘤進展中M-型的CTCs可作為耐藥標志物和新的治療靶點。Baccelli等[35]發現在與乳腺癌患者預后更具相關性的是EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs,而不是所有的EpCAM+CTCs,同時在小鼠模型中證實EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs具有更強的腫瘤形成能力和遠端轉移能力。前期研究表明,腫瘤的轉移具有器官偏好性,CTCs的分群將來可用于轉移病灶的確定。2013年,Zhang[36]從乳腺癌患者的CTCs中鑒定出EpCAM-HER2+/EGFR+/HPSE+/Notch1+CTCs具有特異性腦部轉移。2015年,在結直腸癌中,發現CD110+的腸癌干細胞有非常強的靶向轉移到肝臟的潛能[37]。

在CTC的基因水平上,對轉移性前列腺癌的CTCs進行全外顯子測序發現CTCs中僅70%的突變發生在原發瘤和淋巴轉移樣本,而在CTCs中可發現原發瘤和淋巴轉移樣本中90%的驅動突變和轉移相關突變,提示CTCs可能作為新的治療靶點[38]。同年Yu等[39]在乳腺癌中也發現CTCs比原發腫瘤具有更多的新增突變,根據突變結果進行藥物敏感測試發現,CTCs細胞系的藥物敏感程度與患者一致,不同的突變特征對同一治療方案的敏感程度不同,提示CTCs的基因突變信息可指導腫瘤患者的治療方案的選擇。在非小細胞肺癌和轉移性結直腸癌中均發現CTCs的突變位點能夠很大程度上覆蓋原發灶和轉移病灶的突變。

根據患者CTCs的DNA信息可以指導精準醫療,那么根據RNA的信息是否能起到相同的作用?2012年在小鼠胰腺癌模型的外周血CTCs中發現Wnt2高表達,抑制細胞的失巢凋亡,促進細胞的非依賴性增長[40]。最近Miyamoto等[41]通過對前列腺癌患者CTCs單細胞RNA測序發現,Wnt5a異常高表達減弱了AR抑制劑的抗增殖效應,從而引發AR陽性細胞耐藥,導致患者治療失敗。

結語綜上,相較于常規的腫瘤診斷途徑包括組織病理學分析和高分辨率在體成像技術,CTCs的檢測可無創取樣,并可實時監測患者病情。目前除了對CTCs的檢測技術和生物學特性的研究外,還有體外創建CTCs細胞系[42],利用CTCs來源的小鼠腫瘤模型和類器官模型[43]進行藥物敏感性的預臨床試驗和藥物敏感性分析[44]的探索。對CTCs的檢測與生物學特性的分析將有助于腫瘤患者早期轉移的診斷、輔助精確臨床分期、實時監測術后患者腫瘤復發與轉移、評估預后及合理地選擇個體化的治療策略。

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The biological characteristics and significance of circulating tumor cells in patients with solid malignancies

ZHANG Kai-li2,GAO Xiao-mei2,QIN Lun-xiu1,2,3△

(1DepartmentofGeneralSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2CancerMetastasisInstitute,FudanUniversity,Shanghai200040,China；3InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】Circulating tumor cells (CTCs) are necessary for tumor recurrence and distal metastasis.With the development and progress in the detection technologies of CTCs,more and more attentions have been focused on the biological characteristics and their potential clinical application of CTCs.Cumulating evidence suggests that CTCs are closely related to the prognosis of cancer patients,and may be used in personized cancer treatment.

【Key words】circulating tumor cell;tumor metastasis;cancer therapy

【中圖分類號】R 730

【文獻標識碼】B

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.017

(收稿日期:2015-11-06;編輯:張秀峰)

△Corresponding authorE-mail:qinlx@fudan.edu.cn