p53與bcl-2基因變化在股骨頭缺血性壞死發(fā)病中的影響實(shí)驗(yàn)研究*

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p53與bcl-2基因變化在股骨頭缺血性壞死發(fā)病中的影響實(shí)驗(yàn)研究*

兒童股骨頭缺血性壞死即Perthes 病，多發(fā)于幼兒,病程2～4年，如治療不及時(shí)后期可出現(xiàn)長(zhǎng)造成局部髖關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[1-2]。 研究表明,該疾病的主要以骨細(xì)胞的的凋亡為主要改變的病理過(guò)程[3]。骨組織中含量最多的細(xì)胞是骨細(xì)胞，骨細(xì)胞的凋亡易引起股骨頭骨骺部分或全部壞死。Perthes 病因復(fù)雜， 確切的發(fā)病機(jī)制和病理過(guò)程仍不明確。研究已經(jīng)表明p53調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常凋亡，它對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常活動(dòng)有著重要的作用，而p53與bcl-2以相互拮抗的方式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常活動(dòng)、對(duì)于細(xì)胞正常凋亡有著重要的角色。當(dāng)某種因素造成p53基因突變，表達(dá)異常增加，組織的正常生長(zhǎng)調(diào)控破壞，其代謝發(fā)生變化，可引起骨細(xì)胞大量凋亡[4]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立動(dòng)物 Perthes病模型，觀察股骨頭p53與bcl-2表達(dá)的變化，研究該基因在Perthes疾病中的作用及該病的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)施完成在西北醫(yī)院骨科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，時(shí)間為2011年12月至2012年5月，32只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，雌性和雄性各16只。32只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各半。

2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》進(jìn)行[5]。

2.1 建模：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈注射麻醉，應(yīng)用骨穿刺套針經(jīng)股骨頸穿刺。實(shí)驗(yàn)組至右側(cè)股骨頭骺板遠(yuǎn)側(cè)，向股骨頭內(nèi)注入醫(yī)用TH0.5ml[3]。參照同上方法吸取0.5ml 生理鹽水注射入對(duì)照組右側(cè)股骨頭內(nèi)。動(dòng)物模擬人類(lèi)站立位雙側(cè)髖關(guān)節(jié)負(fù)重的生理狀態(tài)[6-7]。

2.2 取材：于建模術(shù)后第6、8、10、12周分別取兩組動(dòng)物各4只，臀大肌注射人用氯胺酮10 mg/kg，予動(dòng)脈耳緣靜脈內(nèi)注射氣體5ml致氣體栓塞，解剖實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭，并給予 10%甲醛溶液固定。

2.3 病理學(xué)檢測(cè)：標(biāo)本進(jìn)行切片處理固定，顯微鏡下隨機(jī)分成10個(gè)區(qū)域，隨機(jī)記錄每個(gè)區(qū)域內(nèi)100個(gè)骨細(xì)胞，計(jì)算所有區(qū)域內(nèi)細(xì)胞凋亡總數(shù)，測(cè)定p53和bcl-2。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：凋亡細(xì)胞檢測(cè)按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 32只動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間全部存活，5只動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉，給予口服土霉素后癥狀消失。

2 實(shí)驗(yàn)組16只動(dòng)物右下肢于術(shù)后第6周出現(xiàn)跛行；對(duì)照組右下肢活動(dòng)良好，無(wú)異常表現(xiàn)。兩組動(dòng)物體重及毛發(fā)光澤等正常生長(zhǎng)。

3 對(duì)照組右側(cè)股骨頭外觀未見(jiàn)異常，與正常股骨頭基本一致。實(shí)驗(yàn)組第6周時(shí)右側(cè)髖關(guān)節(jié)周?chē)M織開(kāi)始腫脹，出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液及關(guān)節(jié)間隙的增寬，隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)部分股骨頭軟骨面可出現(xiàn)點(diǎn)狀充血，并逐漸擴(kuò)大；到達(dá)第12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組股骨頭雖形態(tài)正常，未見(jiàn)塌陷，但股骨頭軟骨面失去鮮亮色澤，可見(jiàn)骨質(zhì)疏松明顯，骨質(zhì)硬度差，易碎。

4 實(shí)驗(yàn)組右側(cè)股骨頭骨小梁排列紊亂，部分中斷，數(shù)量減少，骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪變性，部分骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；骺板細(xì)胞排列發(fā)生變化，厚度變薄，可見(jiàn)有TH膠存留于骺板小靜脈內(nèi)將其栓塞。對(duì)照組右側(cè)股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量、組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯變化，骨骺厚度及細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。

5 根據(jù)TUNEL試劑標(biāo)準(zhǔn)對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，顯示凋亡細(xì)胞染色呈淡黃色或棕黃色，陽(yáng)性信號(hào)在核內(nèi)分布，周?chē)鸁o(wú)炎性反應(yīng)細(xì)胞，形態(tài)大小不一，核邊界清楚。

6 模型組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率變化，見(jiàn)表1。

7 實(shí)驗(yàn)組右側(cè)股骨頭p53和bcl-2基因的表達(dá)在第8、10、12周分別與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 各組動(dòng)物細(xì)胞凋亡率比較

表2 凋亡誘導(dǎo)及抑制基因率比較( 100%)

8 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組股骨頭骺板細(xì)胞凋亡率與p53基因表達(dá)陽(yáng)性率呈正相關(guān)性(r=0.7,P<0.05)，與bcl-2基因表達(dá)陽(yáng)性率之間呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.7,P<0.01)。

討 論

Perthes 病動(dòng)物模型的建立既是治療研究的基礎(chǔ)，也是研究該病病因及發(fā)病機(jī)制十分重要的手段。國(guó)內(nèi)學(xué)者目前主要是通過(guò)向股骨頭內(nèi)注射醫(yī)用TH膠建立的兒童股骨頭壞死動(dòng)物模型，該方法操作性強(qiáng)，穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)，成功率高。本實(shí)驗(yàn)中所建立的動(dòng)物模型出現(xiàn)了髖關(guān)節(jié)周?chē)M織水腫，軟骨面出現(xiàn)充血變性區(qū)，關(guān)節(jié)間隙增寬與兒童股骨頭軟骨炎的表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制相似， 重現(xiàn)了Perthes病的基本特征，對(duì)于進(jìn)一步研究 Perthes 病提供了可靠模型。

對(duì)于p53與bcl-2基因表達(dá)的研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者長(zhǎng)期致力于Perthes病病因及發(fā)病機(jī)制的研究,目前有諸多學(xué)說(shuō),但其確切機(jī)制還不十分明了。正常情況下當(dāng)細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)常出現(xiàn)組織腫脹及周?chē)装Y反應(yīng)，而該疾病未出現(xiàn)上述變化，目前機(jī)制不明，還不能完全確定該疾病為局部出現(xiàn)了骨壞死[8]。多細(xì)胞生物細(xì)胞死亡的方式為凋亡和壞死,凋亡是指在自身內(nèi)部程序下，在特定的生理或病理?xiàng)l件下細(xì)胞出現(xiàn)死亡過(guò)程。而細(xì)胞壞死是指在非正常情況下，即病理狀態(tài)下細(xì)胞出現(xiàn)的非正常死亡過(guò)程，他們之間非同一種變化，但又有聯(lián)系,細(xì)胞壞死不能向凋亡轉(zhuǎn)化。目前需要明確的是Perthes病中骨細(xì)胞的死亡方式,對(duì)該病的防治有重要意義。當(dāng)出現(xiàn)Perthes疾病時(shí)，局部骨細(xì)胞出現(xiàn)缺血缺氧，使p53凋亡基因異常表達(dá)和bcl-2凋亡抑制基因表達(dá)減少，引起了骨細(xì)胞凋亡及壞死，因此學(xué)者們認(rèn)為Perthes疾病中,骨細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡而非壞死[9]。并且在Perthes病患側(cè)股骨頭骨髓組織體外培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)了當(dāng)骨內(nèi)壓的升高時(shí)可誘發(fā)凋亡基因的表達(dá)的異常活躍，造成骨細(xì)胞的凋亡及生成減少，引起股骨頭壞死[10]。

因此，應(yīng)用TH膠注射法建立兒童股骨頭壞死動(dòng)物模型，造成局部血液循環(huán)障礙，組織缺血水腫，骨內(nèi)壓持續(xù)增高，細(xì)胞在持續(xù)的缺血狀態(tài)下，不能維持自身正常代謝過(guò)程，造成一氧化氮合成酶含量增加,p53的異常表達(dá)增加,而bcl-2抑制凋亡基因表達(dá)的減少，造成骨細(xì)胞生成減少，且出現(xiàn)凋亡增加，最終導(dǎo)致骨壞死。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)引起Perthes病的病因可能為Perthes病微血管病變，它也是引起p53、bcl-2凋亡相關(guān)基因出現(xiàn)異常表達(dá)的原因，從而引起骨細(xì)胞出現(xiàn)大量程序性死亡，引起了兒童股骨頭壞死的發(fā)生。

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(收稿：2015-12-18)

陜西省第四人民醫(yī)院骨二科(西安710043) 張亞斌 龐仲輝 姚永鋒 夏利鋒

目的：觀察p53和bcl-2基因在股骨頭壞死動(dòng)物模型中的變化，了解其在該疾病發(fā)病的作用。方法：32只3個(gè)月齡新西蘭大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(均以幼兔的右側(cè)股骨頭為實(shí)驗(yàn)側(cè))，給予實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物經(jīng)右側(cè)股骨頸注射醫(yī)用TH膠0.5ml致骺板缺血，建立幼兔Perthes 病模型(A組)，以相同方法用給予對(duì)照組右側(cè)股骨頭注射同等劑量生理鹽水(B組)，分別于建模后第6、8、10、12 周取兩組等量動(dòng)物進(jìn)行股骨頭病理切片，觀察兩組股骨頭p53 和bcl-2凋亡基因表達(dá)的變化。結(jié)果：A組p53 基因表達(dá)陽(yáng)性率與股骨頭骺板細(xì)胞凋亡率呈明顯正相關(guān)性(r=0.7,P<0.05)，bcl-2 基因表達(dá)陽(yáng)性率與其之間呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.7,P<0.01)。B組p53與bcl-2基因無(wú)明顯變化。結(jié)論：p53和bcl-2凋亡基因與兒童股骨頭壞死有相關(guān)性。

P53 and the change of the bcl - 2 gene in children experimental study of the influence the incidence of ischemic necrosis of the femoral head

Fourth People's Hospital of Shaanxi Province (Xi’an710043 )Zhang Yabin Pang Zhonghui Yao Yongfeng et al

Objective： to observe the p53 and BCL - 2 gene expression in animal models of children femoral head necrosis, discusses its impact on the pathogenesis of the disease. Methods：32 New Zealand rabbit were randomly divided into experimental group and control group, through the femoral neck give experimental group (group A) the right side of the femoral head in medical TH glue injection of 0.5 ml, giving the control group (group B) the right side of the femoral head in normal saline of 0.5 ml,after 6,8,10,12 weeks observe two groups of femoral head p53 and bcl -2 apoptosis gene expression changes. Results：After modeling group A positive rate of p53 gene expression and femoral head epiphyseal plate apoptosis rate was significantly positive correlation (r= 0.7,P<0.05), the BCL - 2 gene expression was significantly negative correlation between positive rate (r= 0.7,P<0.7), Conclusion: p53 and bcl - 2 apoptosis genes have correlation with children femoral head necrosis.

Femur head necrosis/immunology Genes,p53 Genes,bcl-2 Apoptosis Disease models,animal Rabbits

*陜西省科技廳科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(S2012SF2889)

股骨頭壞死/免疫學(xué) 基因，p53 基因，bcl-2 細(xì)胞凋亡 疾病模型，動(dòng)物 免

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.005