4個家兔群體MC1R基因外顯子的遺傳多樣性分析

梁 爽 （上海交通大學農業與生物學院，上海市閔行區 200240）

4個家兔群體MC1R基因外顯子的遺傳多樣性分析

梁 爽 （上海交通大學農業與生物學院，上海市閔行區 200240）

為探究黑色素皮質素受體1（MC1R）基因外顯子與家兔毛色形成之間的關系，采用PCR-SSCP高溫變性結合DNA測序方法，對4個家兔群體（白色獺兔、青紫藍獺兔、九嶷山兔和閩西南黑兔）的MC1R基因的多態性進行了檢測，并分析了MC1R基因位點突變與家兔毛色之間的相關性。結果表明，MC1R基因外顯子發現了2個等位基因、3種基因型，103-108位點存在AGACGG插入。所有的群體均處于哈代-溫伯格平衡，在所選的4個家兔群體的MC1R基因外顯子中，A等位基因在白色獺兔、青紫藍獺兔和九嶷山兔群體中表現為優勢等位基因，B等位基因在閩西南黑兔群體中表現為優勢等位基因。A等位基因與白色、蛋白色等淺毛色性狀相關，B等位基因與黑色、青紫藍色及海貍色等深毛色性狀相關。

家兔；黑色素皮質素受體1；毛色；遺傳多樣性；PCR-SSCP

哺乳動物的毛色類型很多，這主要是由黑色素細胞產生的黑色素的種類和分布引起。毛色歷來受到生產者的重視，因為毛皮顏色不僅是某一品種的重要標記，而且具有重要的經濟價值，尤其是家兔等的毛皮色。近年來，因家兔毛皮保暖效果高于羊毛，且不需染色，省去加工費用，并減少污染，而日益受到重視。

兔毛纖維顏色的形成及遺傳過程非常復雜，而黑色素皮質激素受體存在多種形式，可在多種細胞上發揮作用，且在黑色素細胞、腎上腺皮質細胞、神經系統和免疫系統中均能表現出不同的藥理學特性。其中，將存在于黑色素細胞中的黑色素皮質素受體稱為“黑色素皮質素受體1（MClR）”。MC1R是獨特的、雙功能控制受體，是黑色素細胞接受動物激素調控的主要受體之一，MC1R基因為G蛋白偶聯受體家族成員，由extension基因座編碼，長度為310個氨基酸（牛是317個、雞是314個）。MC1R基因只有1個外顯子，其蛋白有7個跨膜結構域，為最小的G蛋白偶聯受體。a-MSH（a-促黑色素細胞激素）與ACTH （促腎上腺皮質激素）是MC1R的配體[1]，它們與黑色素細胞膜上的MC1R結合后，使與受體偶聯的G蛋白由無活性的二磷酸鳥苷（GDP）型轉變為有活性的三磷酸鳥苷（GTP）型，激活膜上的腺苷酸環化酶系統，三磷酸腺苷（ATP）轉變為環腺苷酸（cAMP），cAMP進一步激活酪氨酸激酶，活化酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）催化黑色素細胞內的酪氨酸生成多巴，多巴在黑素體內聚積到一定量后釋放黑色素。如黑色素細胞中的TYR過量，多巴及多巴醌將通過各自的通道合成真黑色素。相反，如黑色素細胞中的TYR過少，酪氨酸則轉化為半胱氨酰多巴，導致偽黑色素的廣泛表達[2]。MC1R接受a-MSH的信號，一方面通過黑色素細胞內c-AMP第二信使參與上調酪氨酸酶的表達量，進而促進真黑色素的合成；另一方面可促進黑色素細胞的增殖[3]，對動物毛色形成起到重要作用。近年來，關于MC1R的研究，開始著眼于其基因型及基因多態性方面，并已在實驗動物小鼠、牛、馬、犬、雞、豬及人類毛發顏色及膚色等方面取得了一些顯著成果[4-7]。目前，有關毛用動物MC1R基因多態性的研究報道較少。本研究借鑒其他動物的研究方法，以閩西南黑兔、青紫藍獺兔、白色獺兔和九嶷山兔為試驗材料，采用單鏈構象多態性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析技術，研究了家兔的MC1R基因多態性，以期解釋家兔在MC1R上的基因分型，并為從分子遺傳學角度揭示家兔被毛顏色形成機理提供一定的依據。且MC1R基因位點的全面檢測將為家兔品種資源的保存和利用提供參考，今后可利用先進的分子生物技術和基因工程技術來完善家兔的基因圖譜。另外，從表型出發對MC1R基因進一步深入研究，將毛色作為一種遺傳標記，利用某種毛色來直接選育近交系，可利用該動物的某種毛色，以迎合人們的喜好培育出各色的寵物兔[8]。因此，有必要進一步研究家兔的MC1R外顯子的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

本研究選取4個群體共354只家兔為試驗材料，其中，60只閩西南黑兔來自福建省農科院，94只青紫藍獺兔和132只白色獺兔均來自浙江余姚兔場，68只九嶷山兔來自湖南省寧遠縣九嶷山兔原種場。所有個體均為隨機抽樣，耳緣靜脈采血5 mL，并采用酚/氯仿的方法進行總DNA提取[3]。

1.1.2 試劑和器材

試劑包括PCR反應的試劑[寶生物工程（大連）有限公司]，PBR322/Marker（天根生物工程公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇等常規試劑（國藥有限公司）。

器材包括96孔PCR板、Eppendorff移液器（10-1 000 μL）、IQ凝膠成像系統、離心機、Eppendorff Thermal Cycler PCR儀、恒溫水浴搖床、NanoDrop ND-1 000濃度測定儀等。

1.1.3 主要試劑配置

（1）0.5%肝素鈉。0.5 g肝素溶于100 mL生理鹽水。

（2）裂解液。蒸餾水600 mL，尿素120.12 g，1M Tris 100 mL，EDTA-Na-2H2O37.2 g，20% SDS 50 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。（3）1 M Tris緩沖液（pH 8.0）。800 mL ddH2O中加入121.1 g Tris堿，HCl調節pH至8.0，定容至1 000 mL，分裝后高壓滅菌。（4）10% SDS（500 mL）。將50 g SDS加入400 mL水中，加熱攪拌溶解，定容后高壓滅菌。（5）TE緩沖液（pH 8.0）。10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA。（6）20 mg/mL蛋白酶K。100 mg蛋白酶K溶于5 mL滅菌ddH2O，-20 ℃保存備用。（7）30%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=49∶1）。800 mL水中溶解294 g丙烯酰胺，6 g甲叉雙丙烯酰胺，定容至1 L，置于4 ℃保存。（8）10 × TBE。Tris-Base 108 g，硼酸55 g，EDTA 7.444 g，800 mL水中溶解，調節pH至8.0，定容至1 L，室溫保存。（9）50×TAE。Tris-Base 242 g，EDTA 37.2 g，57.1 mL醋酸，定容至1 L，室溫保存。（10）10%過硫酸胺（AP）。l0 mL水中溶解1 g過硫酸銨，加水至10 mL，置于4 ℃保存。（11）含10%丙烯酰胺PAGE膠（總量30 mL）。30%丙烯酰胺貯存液10 mL，1×TBE 20 mL，TEMED 30μL，10%AP 200μL。（12）100 ng/ μL DNA。分別吸取4個兔品種100 ng/μL DNA各20μ L，至同一個1.5 mL 離心管中，用100μL移液器緩慢吹打混勻，4 ℃保存備用。1.1.4 DNA提取

使用醫用一次性真空采血管（肝素鋰抗凝）從供試家兔耳緣靜脈采取血樣，每只采樣量為5～10 mL，0.5%肝素鈉抗凝，置冰盒帶回實驗室，低溫低速離心5 min小心去除上層血漿，于-20 ℃低溫保存血細胞。血液基因組DNA參照《分子克隆實驗指南》[9]，略加修改，進行抽提，解凍后取紅細胞20μL于1.5 mL 離心管中，加入500μL兔血裂解液、10μL 10%SDS、10μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，55℃水浴過夜；加入等體積Tris飽和酚，搖20 min后，于12 000 rpm離心10 min；移出上清液，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，V/V/V），搖15 min后，再于12 000 rpm離心10 min；再加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，V/V/V），搖15 min后，于12 000 rpm離心10 min；抽提上清液中加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）搖15 min，于12 000 rpm離心10 min；抽提上清液中加入2倍體積的無水乙醇，輕搖、沉淀DNA。于7 500 rpm離心5 min，小心傾倒出乙醇；70%乙醇洗滌2次。自然干燥，加300μL TE溶解。待DNA完全溶解后，采用NanoDrop ND-1000濃度測定儀檢測樣本DNA的濃度和純度，并將其稀釋到100 ng/μL分裝備用。DNA原液置于-20 ℃長期保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計和PCR的擴增

本試驗參考GenBank中公布的其他物種序列進行Blast，利用Primer 5、Oligo 6.0進行引物設計。

引物序列為F1：5’-TTGCCATCGCCAAGAACCG-3’

R1：5’-CAGGAAGCAGAGGCTGGACAC-3’

PCR反應體系20μL：10×PCR （Mg2+·free） Buffer 2μL，25 mmo1/L MgCl20.8-1.5μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶1.0 U，100 ng/μL DNA模板1μL，ddH2O補齊20μL。

PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖膠電泳檢測。1.2.2 瓊脂糖檢測

稱取0.4 g瓊脂糖于三角瓶中，用40 mL 1×TAE緩沖液在微波爐中加熱溶解；待液體冷卻至60 ℃左右時，加入1.0μL GoldView核酸染色劑，混合均勻，倒入載膠板中，冷卻10～20 min至完全凝固；小心拔下梳子，將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，注入足量的1×TAE；取5μL待檢測產物和0.5μL上樣緩沖液，吹打均勻后用微量移液器將樣品混合液和DNA Marker（PB322 Marker）分別移入凝膠孔中；在150 V電壓下電泳15 min左右，結束后用凝膠成像系統檢測，有產物條帶可進行后續工作。

1.2.3 PCR-SSCP分析

將5μL PCR產物和5μL上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯青、10 mmol/L EDTA（pH 8.0）、2%甘油]，于98 ℃變性10 min，迅速插入冰中，放置10 min，使之保持單鏈狀態。樣品在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，清洗制膠用的玻璃板、墊條和梳子，晾干后用夾子夾緊玻璃板和墊條間的縫隙，略傾斜放置以備用。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，向50 mL錐形瓶中加入10 mL 30%丙烯酰胺貯存液（49∶1）、16 mL 1×TBE緩沖液、200μL 10% AP和30μL TEMED，混均后迅速灌膠（注意灌膠時不要有氣泡）；當灌膠至離玻璃板上約0.5 cm時停止，小心插入梳子（注意排出氣泡），將玻璃板平放于桌面上，室溫等待20 min左右（視具體情況而定），使膠充分凝固；取出下側墊條及上端梳子，放入盛1×TBE的電泳槽，沖洗加樣孔（用力適度，勿沖壞點樣孔），于80 V電壓下預電泳5～10 min；取10 μL PCR產物與3μL上樣緩沖液充分混合，再取5μL混合液，用微量移液器加入點樣孔中；插上電源，于250 V電壓下電泳跑膠等條帶分開后，將電壓調至130 V電泳跑膠8 h左右。電泳結束后，銀染顯帶。取膠，用固定液固定l0 min，倒掉固定液，用蒸餾水洗2～3次；然后用硝酸銀溶液染色20 min，倒掉染色液，用蒸餾水洗2～3次（注意清洗速度要快）；加入NaOH溶液，3～5 min后加入甲醛，直至出現清晰的條帶染色結束，用蒸餾水洗2～3次，整個過程都在水平搖床上進行。裝膠，標號，凝膠成像系統拍照備用。根據聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶結果，進行SSCP分析。

1.3 數據分析

統計基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量（PIC）、

期望雜合度（He），并對各群體基因型分布差異進行卡方檢驗，采用Align軟件進行序列比對和突變位點的篩查。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及測序結果

MC1R基因外顯子PCR產物經SSCP檢測后發現3種基因型（AA、AB和BB型）（見圖1）。B等位基因在所擴增序列103-108位點存在AGACGG插入（見圖2），從而導致所編碼的多態鏈可能插入了2個精氨酸。

圖1 PCR-SSCP產物電泳

圖2 部分外顯子不同基因型測序結果注：103-108位點處存在AGACGG插入。

2.2 不同家兔群體的遺傳多樣性分析

在本研究檢測的群體中，3種基因型在4個群體中都有被檢測到，且家兔群體均處于哈代-溫伯格平衡（見表1）。青紫藍獺兔群體表現為中度多態，其余3個群體表現為低度多態。其中，青紫藍獺兔期望雜合度和多態信息含量最高，分別為0.474和0.362；白色獺兔群體期望雜合度和多態信息含量最低，分別為0.100和0.095。青紫藍獺兔、閩西南黑兔分別與其他3個家兔群體之間基因型分布差異達極顯著（P＜0.01），白色獺兔與九嶷山兔之間無顯著性差異（P＞0.05）（見表2）。

表1 4個家兔群體MC1R基因外顯子的遺傳特性

表2 不同群體間基因型分布的卡方檢驗

3 結論與討論

目前，對哺乳動物中的MC1R基因已有部分研究報導，有人認為，MC1R是迄今唯一發現的控制人部分正常色素色譜的基因[10]；鼠MC1R（E位點）已被識別，并發現MC1R位點的編碼區序列的差異性與毛發顏色有關[11]；犬MC1R基因已定位，同時犬全基因組測序也已初步完成[12]；MC1R基因是雞黑色素性狀的主效基因，或是與雞控制黑色素性狀的主效基因連鎖[13]；豬MC1R基因定位于6號染色體短臂末端[14]；牛黑色素皮質素受體基因不僅與毛色有關，而且與牛乳中乳蛋白的含量有關，其定位在第18號染色體上[15]；Guiling Dun等利用PCR-RFLP和PCR-SSCP等技術對杜洛克、長白、大白豬的MC1R基因進行研究，發現了5個多態位點，其中，5′非編碼區668位點發生G（C）突變，其余4個多態位點為894位點CC插入，1 318C（T），1 554G（A）和1 197G（A）突變發生在編碼區；894位點CC插入導致編碼蛋白過早終止；所有突變位點無雜合子出現；并推測668G（C）、1 318C（T）和1 554G（A）可能與杜洛克的紅色毛存在相關，而1 197G（A）突變及894位點CC插入可能與長白、大白豬的白色毛存在相關[16]；Evagelia A等利用PCR-RFLP技術對希臘野豬、家豬雜交后代中MC1R基因突變進行測定發現，育種場內雜交豬種存在16.7%的突變性，而野生型豬只有5%，并認為MC1R基因對哺乳動物毛囊黑色素細胞有調節作用，MC1R基因的多態性與動物的不同毛色有關[17]。

在本試驗所選的4個家兔群體的MC1R基因外顯子中，A等位基因在白色獺兔、青紫藍獺兔和九嶷山兔群體中表現為優勢等位基因，B等位基因在閩西南黑兔群體中表現為優勢等位基因。χ2獨立性檢驗結果表明，所研究的4個群體均處于哈代一溫伯格平衡狀態，說明這4個群體可能在人工選育、遺傳漂變等作用下，這些座位處于動態平衡之中。青紫藍獺兔期望雜合度和多態信息含量最高，分別為0.474和0.362；白色獺兔群體期望雜合度和多態信息含量最低，分別為0.100和0.095，這可能與實際生產中高度選種選育有關。青紫藍獺兔、閩西南黑兔分別與其他3個家兔群體之間基因型分布差異達極顯著，白色獺兔與九嶷山兔之間無顯著性差異。閩西南黑兔毛色主要表現為黑色，青紫藍獺兔毛色主要以青紫藍色、黑色居多；而白色獺兔毛色主要以蛋白色、白色居多；九嶷山兔毛色主要以純白色、純灰色居多。即表明A等位基因與白色、蛋白色等淺毛色性狀相關，B等位基因與黑色、青紫藍色及海貍色等深毛色性狀相關。但對于該突變具體如何影響家兔毛色性狀，還需要做進一步的深入研究。

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2016-05-09