HPLC-Q-TOF-MS/MS法檢測降壓類中成藥中非法添加的24種化學物質Δ

凌海燕，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東（四川省中醫藥科學院，成都 610041）

HPLC-Q-TOF-MS/MS法檢測降壓類中成藥中非法添加的24種化學物質Δ

凌海燕＊，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東#（四川省中醫藥科學院，成都 610041）

目的：建立檢測降壓類中成藥中非法添加的24種化學物質的方法。方法：采用高效液相色譜-飛行時間串聯質譜法。色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18，流動相為0.05%甲酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.3 ml/min，柱溫為30℃，進樣量為5 μl。質譜條件：離子源為電噴霧電離源，毛細管電壓為4.0 kV，毛細管出口電壓為135 V，錐孔電壓為65 V，脫溶劑溫度為350℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓力為40 psi，碰撞能量為8～45 V，掃描范圍為m/z 100～1 700，檢測方式為正離子模式（ESI+）。結果：卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定、利血平檢測質量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L，苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測質量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L，其余14種化學物質檢測質量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L（r≥0.995 9）；定量限≤2.944 1 ng，檢測限≤0.988 5 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD≤5.1%；回收率為81.5%～115.5%（RSD＝1.81%～4.86%，n＝9）。結論：該方法專屬性強、靈敏度高、簡便快捷，適用于降壓類中成藥中非法添加化學物質的檢測。

高效液相色譜-飛行時間串聯質譜法；降壓類中成藥；化學物質；非法添加

由于我國高血壓患病率逐年攀升，使得治療高血壓的藥物幾乎成為每個家庭的必備藥。不少患者傾向于選擇毒副作用小的中藥復方制劑，不法分子利用這種心理，在降壓中成藥中非法摻入療效確切、價廉的降壓化學物質，服用者雖可收到立竿見影的效果，但會造成化學藥品用法用量的無法控制、重復用藥，對患者身體帶來極大損害。由于中成藥成分和生產工藝的復雜性，不可能與化學物質同時進行全程檢測，所以添加的化學物質不易被識別，具有隱蔽性。目前，用于檢測中成藥中非法添加化學物質的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法[1-3]等，隨著質譜技術的發展，高分辨質譜越來越受到人們的關注，與串聯四級桿質譜相比，高分辨質譜具有掃描速度快、分辨率高等優點[4-5]。

本試驗建立的HPLC-飛行時間串聯質譜法（Q-TOF-MS/ MS）具有高靈敏度、高選擇性的特點，可以獲得高質量質譜圖和化學物質精確分子質量，操作簡便、快速、準確，結果可靠。

1 材料

1.1 儀器

LC-Q-TOF聯用儀（美國Agilent公司）；KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

試驗所用樣品均為市售降壓類丸劑、片劑、膠囊劑中成藥（編號：1～12）；卡托普利對照品（批號：100318-201103）、氯沙坦鉀對照品（批號：100597-201102）、纈沙坦對照品（批號：100651-201203）、替米沙坦對照品（批號：100629-201202）、坎地沙坦酯對照品（批號：100685-200401）、奧美沙坦酯對照品（批號：100864-201302）、酒石酸美托洛爾對照品（批號：100084-201102）、阿替洛爾對照品（批號：100117-201105）、富馬酸比索洛爾對照品（批號：100711-200401）、鹽酸普萘洛爾對照品（批號：100783-201202）、尼莫地平對照品（批號：100270-200002）、尼群地平對照品（批號：100585-201104）、苯磺酸氨氯地平對照品（批號：100374-201204）、硝苯地平對照品（批號：100338-201404）、拉西地平對照品（批號：100741-200802）、鹽 酸 尼 卡 地 平 對 照 品（批 號 ：100586-201102）、非洛地平對照品（批號：100717-201403）、甲磺酸多沙唑嗪對照品（批號：100566-200401）、鹽酸肼屈嗪對照品（批號：100263-200301）、氫氯噻嗪對照品（批號：100309-201404）、鹽酸可樂定對照品（批號：100071-201106）、利血平對照品（批號：100041-201213）、吲達帕胺對照品（批號：100257-201204）、鹽酸哌唑嗪（批號：100147-201206）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水（18.25 mΩ/cm）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：0.05%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 min，10%B；0～5 min，10%→60%B；5～15 min，60%→95%B；15～20 min，95%B；20～25 min，10%B）；流速：0.3 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：5 μl。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離（ESI）源；毛細管電壓：4.0 kV；毛細管出口電壓：135 V；錐孔電壓：65 V；脫溶劑溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：40 psi；碰撞能量：8～45 V；掃描范圍：100～1 700 m/z；檢測方式：正離子模式（ESI+）。在ESI+模式下，各化學物質有較好的分離度，并且24種化學物質在20 min內出峰，檢測時間較短，在進行非法添加篩查時可以大大提高效率。總離子流見圖1。

圖1 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取坎地沙坦酯、卡托普利、氯沙坦鉀、奧美沙坦酯、尼群地平、替米沙坦、纈沙坦、阿替洛爾、非洛地平、酒石酸美托洛爾、鹽酸普萘洛爾、硝苯地平、尼莫地平、鹽酸可樂定、苯磺酸氨氯地平、利血平、拉西地平、鹽酸哌唑嗪、鹽酸尼卡地平、吲達帕胺、甲磺酸多沙唑嗪、氫氯噻嗪、鹽酸肼屈嗪、富馬酸比索洛爾對照品10.05、9.97、9.52、10.23、10.12、10.54、10.09、9.14、9.69、10.48、9.89、10.20、10.27、9.60、10.17、10.15、9.62、9.24、9.77、9.62、9.19、10.23、10.32、10.16 mg，精密稱定，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為單一對照品貯備液。精密量取上述單一對照品貯備液1 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取片劑或丸劑樣品研細，混勻，或取膠囊劑，取出內容物連同膠囊殼細致研磨粉碎，取一次口服劑量，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇補足減失的質量，濾過，取濾液1.00 ml，置于10 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，作為供試品溶液。

2.2.3 空白樣品溶液 缺樣品，按“2.2.2”項下方法制備空白樣品溶液。

2.3 24種化學物質的標準譜庫信息

建立24種化學物質的分子式、精確質量數、二級特征碎片離子以及保留時間等信息數據庫（見表1），通過分析軟件分別對待測成分的一級和二級質譜圖與數據庫中質譜圖進行比對，同時結合保留時間進行進一步實證。

表1 標準譜庫信息Tab 1 Information of standard reference library

續表1Continued tab 1

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 ml，分別置于50 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 μl，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。結果表明，卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定、利血平檢測質量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L；苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測質量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L；其余14種化學物質檢測質量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L。

表2 回歸方程與定量限、檢測限Tab 2 Regression equations，limits of detection and limits of quantification

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，24種化學物質峰面積的RSD＝2.6%～4.9%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、18、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，24種化學物質峰面積的RSD＝2.3%～5.1%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（編號：6）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄氫氯噻嗪峰面積。結果，氫氯噻嗪的添加量為3.50 g/kg，RSD＝4.0%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

取空白樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表3。

表3 回收率試驗結果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

續表3Continued tab 3

2.10 樣品中化學物質的測定

取12種市售降壓中成藥各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣檢測，若檢出，則計算化學物質含量，結果見表4。

3 討論

國家食品藥品監督管理局頒發的補充批件（編號2009032）[6]僅對降壓中成藥中的7種降壓類化學物質（阿替洛爾、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、硝苯地平）進行篩查和驗證，篩查的對象遠遠少于本研究所選擇的24種化學物質，故本研究方法的適用范圍更廣。這24種化學物質極性差別大，要在同一個色譜系統中實現色譜分離需要較長時間，且有部分成分的色譜保留行為相似，分離度較差，例如尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、非洛地平、苯磺酸氨氯地平等。因此，采用EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）填料的色譜柱，建立的HPLC-Q-TOF-MS/MS法測定降壓中成藥中非法添加的化學物質的定性定量檢驗方法，能夠在20 min內完成24種降壓類化學物質的有效分析，并排除了中成藥中復雜成分的干擾，且從保留時間、一級及二級質譜的一致性等方面保證了定性定量的準確，簡便和高靈敏度。在缺乏對照品的情況下，可以將未知樣品的特征譜圖與譜庫信息進行匹配，以此實現短時間內對未知成分進行初步篩查和確認的目的。這是一個開放的系統，可以隨時增加新的化學物質，只要將相應的數據錄入質譜數據庫，便可進行日常檢驗篩查，為用藥安全提供技術支持。

表4 樣品中非法添加化學物質檢測結果（n＝3）Tab 4 Detection results of the chemical substances that illegally added in samples（n＝3）

[1] 陳惠玲，封令霞.HPLC檢測中藥中非法添加化學降壓藥物[J].中國現代應用藥學，2011，28（13）：1 346.

[2] 陳海濱，吳春敏.降壓類中成藥非法添加化學藥物研究近況[J].海峽藥學，2010，22（10）：1.

[3]李濤，朱小紅，林芳.GC-MS聯用方法檢測降壓類中成藥及保健食品中非法添加的化學藥物[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2 212.

[4] 吳寧鵬，班付國，彭麗，等.超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜法篩查飼料中11種鎮靜劑類藥物[J].質譜學報，2012，33（2）：94.

[5] 謝寒冰，周明瑩，趙海峰，等.高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法同時檢測豆芽中的3種外源植物激素殘留

[J].色譜，2014，32（5）：493.

[6] 國家食品藥品監督管理局.藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件[S].2009.

Detecion of 24 Chemical Substances that Illegally Added into Antihypertensive Traditional Chinese Patent Medicines by HPLC-Q-TOF-MS/MS

LING Haiyan，TANG Yan，ZHU Ning，YANG Jun，WEN Xiao，YANG Andong（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the detection of 24 chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.METHODS：HPLC-Q-TOF-MS/MS was adopted.The chromatographic conditions were as follows，the column was Agilent Poroshell 120 EC-C18with mobile phase of 0.05%formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 0.3 ml/min，column temperature was 30℃，injection volume was 5 μl.MS conditions were as follows，ion sou-rce was an electrospray ionization source，capillary voltage was 4.0 kV，capillary exit voltage was 135 V，cone voltage was 65 V，desolvation temperature was 350℃，drying gas flow rate was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 8-45 V；scanning range was m/z 100-1 700；and detection method was positive ion mode（ESI+）.RESULTS：The linear range was 2.0-32 μg/L for captopril nifedipine，hydrochlorothiazide，clonidine hydrochloride，reserpine，3.0-48 μg/L for amlodipine besylate，felodipine，valsartan，lacidipine，candesartan cilexetil and 2.5-40 μg/L for the other 14 chemical substances（r≥0.995 9）；limit of quantification was not higher than 2.944 1 ng，the limit of detection was not higher than 0.988 5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no higher than 5.1%；recoveries were 81.5%-115.5%（RSD were 1.81%-4.86%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is specific，sensitive，simple and rapid，and suitable for the detection of chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.

HPLC-Q-TOF-MS/MS；Antihypertensive traditional Chinese patent medicine；Chemical substances；Illegal added

R917

A

1001-0408（2016）33-4712-04

2016-03-28

2016-07-14）

（編輯：張 靜）

四川省公益性科研院所基本科研項目（No.A-2015N-7）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥及天然產物新產品開發。電話：028-85257327。E-mail：hyan1012@126.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥及天然產物新產品開發、中藥質量標準和中藥材綜合應用與成套技術開發。E-mail：ady-05@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.35