參附益腎膠囊的質量標準研究

盛春帥，周 鵑，李海霖（青海省中醫院，西寧 810000）

參附益腎膠囊的質量標準研究

盛春帥＊，周 鵑，李海霖#（青海省中醫院，西寧 810000）

目的：建立參附益腎膠囊的質量標準。方法：檢測制劑中手參的顯微特征；采用薄層色譜法（TLC）對制劑中丹參、大黃、甘草、紅景天、肉桂進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中黃芪甲苷的含量：色譜柱為Phenomenex Luna-C18，流動相為乙腈-水（35∶65，V/V），流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃。結果：制劑中手參顯微特征顯著。丹參、大黃、甘草、紅景天、肉桂TLC圖斑點清晰，分離度好。黃芪甲苷檢測進樣量線性范圍為0.832 8～4.164 0μg（r＝0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD≤2.03%；加樣回收率為95.02%～104.33%（RSD＝3.80%，n＝6）。結論：該研究所建標準可用于參附益腎膠囊的質量控制。

參附益腎膠囊；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芪甲苷

糖尿病腎病是糖尿病引起的危害性極大的一種慢性并發癥。近些年，隨著來我院內分泌、腎病專科就診患者的不斷增加，我院專家通過多年的臨床觀察，發現由于高海拔地區，自然氧氣稀薄，清氣不足，加之寒盛易傷陽氣、干燥多風易傷陰津，使該地區糖尿病腎病多以陽虛血瘀型為主，故采用黃芪、午參、水蛭、大黃、附子等中、藏藥組方，且在臨床治療糖尿病腎病、慢性腎炎、慢性腎功能不全中取得了很好的效果。為方便患者并配合臨床治療，醫院將此組方制成膠囊作為醫院制劑供臨床使用。為有效控制該制劑質量，筆者對該制劑中的藏藥手參進行了顯微鑒別；對丹參、大黃、甘草、紅景天、肉桂進行了薄層色譜法（TLC）鑒別；對制劑中主要成分黃芪甲苷采用高效液相色譜法（HPLC）進行了含量測定[1-4]。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括Ⅱ蒸發光散射檢測器、四元泵（美國Agilent公司）；BX51型顯微鏡（日本Olympus公司）；BT224S型電子天平、XS105DU型電子天平（德國Sartrious公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）。

1.2 藥品與試劑

參附益腎膠囊（青海省中醫院自制，批號：20140822、20141202、20140925，規格：0.4 g/粒）；丹酚酸B對照品（批號：111562-201212，純度＞98%）、大黃素對照品（批號：110756-201319，純度＞98%）、紅景天苷對照品（批號110818-201206，純度＞98%）、肉桂酸對照品（批號：110786-200503，純度＞98%）、黃芪甲苷對照品（批號：110831-200302，純度＞98%）、大黃對照藥材（批號：120902-201010）、甘草對照藥材（批號：120904-201318）、紅景天對照藥材（批號：121412-200902）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

手參、紅景天藥材，購自青海省九康藥材飲片有限公司，由本院趙克宏副主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別[5-7]

以處方中原粉藥材入藥的手參為對照，取本品適量，置顯微鏡下觀察，可見草酸鈣針晶束長24～50 μm，散在或存在于類圓形或橢圓形黏液細胞中，詳見圖1。

2.2 定性鑒別

2.2.1 丹參 取本品內容物3 g，研細，加70%乙醇30 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，取濾液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，用稀鹽酸調pH至2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對照品，加70%乙醇制成丹酚酸B質量濃度為1 mg/ml的對照品溶液。按參附益腎膠囊處方和工藝制備缺丹參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液，置日光燈下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

圖1 手參的顯微圖Fig 1 Microscopic characteristics of Gymnadenia conopsea

圖2 丹參的薄層色譜圖1～3.供試品；4.對照品；5.陰性對照Fig 2 TLC chromatograms of Salvia miltiorrhiza1-3.test samples；4.reference substance；5.negative control

2.2.2 大黃 取本品內容物2 g，研細，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，取濾液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，再加鹽酸1 ml，置水浴上加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，合并乙醚提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對照品，加甲醇制成大黃素質量濃度為1 mg/ml的對照品溶液。再取大黃對照藥材0.2 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按參附益腎膠囊處方和工藝制備缺大黃的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖3。

2.2.3 甘草 取本品內容物5 g，研細，加甲醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 ml溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇溶液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按參附益腎膠囊處方和工藝制備缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，于105℃下加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖3 大黃的薄層色譜圖1～3.供試品；4.對照藥材；5.對照品；6.陰性對照Fig 3 TLC chromatograms of Rheum palmatum1-3.test samples；4.control medicinal herb；5.reference substance；6.negative control

圖4 甘草的薄層色譜圖1～3.供試品；4.對照藥材；5.陰性對照Fig 4 TLC chromatograms of Glycyrrhiza uralensis1-3.test samples；4.control medicinal herb；5.negative control

2.2.4 紅景天 取本品內容物5 g，研細，加甲醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取紅景天苷對照品，加甲醇制成紅景天苷質量濃度為1 mg/ml的對照品溶液。再取紅景天對照藥材5 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按參附益腎膠囊處方和制備工藝制備缺紅景天的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述4種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-水（6∶3∶1∶1，V/V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏約3 min，置日光燈下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖5。

圖5 紅景天的薄層色譜圖1～5.供試品；6.對照藥材；7～8.對照品；9.陰性對照Fig 6 TLC chromatograms of Rhodiola rosea1-5.test samples；6.control medicinal herb；7-8.reference substances；9. negative control

2.2.5 肉桂 取本品內容物5 g，研細，加乙酸乙酯40 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液低溫揮干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取肉桂酸對照品，加無水乙醇制成肉桂酸質量濃度為1 mg/ml的對照品溶液。按參附益腎膠囊處方和工藝制備缺肉桂的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙醚-冰乙酸（5∶5∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖6。

圖6 肉桂的的薄層色譜圖1～3.供試品；4.對照品；5.陰性對照Fig 6 TLC chromatograms of Cortex cinnamomi1-3.test samples；4.reference substance；5.negative control

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。在上述色譜條件下，理論板數以黃芪甲苷峰計≥4 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5；供試品溶液色譜圖中，在與黃芪甲苷對照品色譜峰相應的位置上，有相同的色譜峰，陰性略有干擾，但從峰值上看，干擾極小，詳見圖7。

圖7 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.黃芪甲苷Fig 7 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.astragaloside

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品0.010 41 g，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成黃芪甲苷質量濃度為0.208 2 mg/ml的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品內容物適量，研細，取10 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水50 ml，稱定質量，超聲處理40 min，放冷，稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 ml，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次30 ml，棄去，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 按參附益腎膠囊處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，并按“2.3.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 線性關系考察 分別精密量取“2.3.2”項下對照品溶液4、8、12、16、20μl，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程為y＝3.564 9+1 281.1x（r＝0.999 9）。結果表明，黃芪甲苷檢測進樣量線性范圍為0.832 8～4.164 0μg。

2.3.6 精密度試驗 取“2.3.2”項下對照品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝0.30%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液（批號：20140925）適量，分別于室溫下放置0、2、3、4、6、8 h時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝0.53%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20140925）適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，黃芪甲苷的平均含量為0.31 mg/g，RSD＝2.03%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：20140925）適量，共6份，分別加入一定質量的黃芪甲苷對照品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.3.10 樣品含量測定 取3批樣品適量，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

3 討論

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

本制劑為水提取的復方制劑，因而在TLC鑒別成分中以水溶性成分為對照品，除丹參素鈉分離效果不好外，丹酚酸B、大黃素、紅景天苷、肉桂酸，分離效果均較好，斑點清晰，因此將以上成分作為對照品列入標準。

考慮到黃芪提取方法的影響因素，筆者對提取過程中氨水洗滌因素、大孔吸附樹脂因素、漂移管溫度等進行了相關試驗，最終確定了以氨水洗滌，選用D101型大孔吸附樹脂柱，漂移管溫度設定為50℃，這也使試驗結果更加可靠。

從HPLC測定結果來看，由單方配方顆粒制成的樣品含量略高于由藥材提取制成的樣品，這可能是藥材混合提取時，各成分之間有相互抑制的作用，從而導致黃芪甲苷含量略低[9-10]。

綜上所述，本研究所建標準可用于參附益腎膠囊的質量控制。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：23、76、86、136、154.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：藏藥：第一冊[S].北京：人民衛生出版社，1995：25、29、126、231.

[3] 國家食品藥品監督管理局.國家食品藥品監督管理局標準（試行）[S].YBZ12512005.

[4] 國家食品藥品監督管理局.國家食品藥品監督管理局標準（試行）[S].YBZ16142009.

[5] 青海省藥品檢驗所，青海省藏醫藥研究所.中國藏藥：第一卷[M].上海：上海科學技術出版社，1996：548.

[6] 青海省藥品檢驗所，青海省藏醫藥研究所.中國藏藥：第二卷[M].上海：上海科學技術出版社，1996：310.

[7] 徐國鈞.中藥材粉末顯微鑒別[M].北京：人民衛生出版社，1986：52、416.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：57.

[9] 趙陸華.中藥高效液相色譜法應用[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：326.

[10] 周訓蓉，楊亮.金烏健骨膠囊的質量標準研究[J].中國藥房，2015，26（30）：4 247.

（編輯：張 靜）

Study on Quality Standard of Shenfu Yishen Capsule

SHENG Chunshuai，ZHOU Juan，LI Hailin（Qinghai Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xining 810000，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Shenfu yishen capsule.METHODS：The microscopic characteristics of Gymnadenia conopsea were detected；TLC was adopted for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza，Rheum palmatum，Glycyrrhiza uralensis，Rhodiola rosea and Cortex cinnamomi；HPLC was used for the content determination of astragaloside：the column was Phenomenex Luna-C18with mobile phase of acetonitrile-water（35∶65，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，column temerpature was 30℃.RESULTS：Microscopic identification features of G.conopsea were exclusive，TLC identification of S.miltiorrhiza，R.palmatum，G.uralensis，R.rosea and C.cinnamomi was well separated and specific；the linear range of astragaloside was 0.832 8-4.164 0μg（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no higher than 2.03%；recovery was 95.02%-104.33%（RSD＝3.80%，n＝6）.CONCLUSIONS：The standard can effectively control the quality of Shenfu yishen capsule.

Shenfu yishen capsule；Quality standard；TLC；HPLC；Astragaloside A

R284.1

A

1001-0408（2016）33-4735-04

2015-11-01

2016-03-16）

＊主管藥師。研究方向：中藥制劑。E-mail：shengcs8587@163. com

#通信作者：主任藥師。研究方向：中藥制劑。E-mail：3345666989@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.43