青連寧心膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

司席席，孫洪勝，曹廣尚，陳倩倩，劉 丹（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 50355；.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 500）

青連寧心膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

司席席1＊，孫洪勝2#，曹廣尚2，陳倩倩1，劉 丹1（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011）

目的：建立青連寧心膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中黃連、青蒿進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中青蒿素的含量：色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（45∶55，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：黃連、青蒿的TLC斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。青蒿素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5.62～56.2 μg/ml（r＝0.999 4）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD＜1.0%；加樣回收率為97.46%～99.72%（RSD＝0.75%，n＝6）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于青連寧心膠囊的質(zhì)量控制。

青連寧心膠囊；青蒿素；高效液相色譜法；薄層色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

快速性心律失常是臨床上常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病，屬于中醫(yī)“心悸”范疇，具有起病急、病情復(fù)雜、治療效果不佳等特點(diǎn)。青連寧心膠囊由黃連和青蒿兩味藥材組合而成，方中黃連味苦，性寒，有清熱瀉火、燥濕解毒之效；青蒿味苦、辛，性寒，有清熱除蒸、化濕消痰之功。二藥合用共奏清熱化痰、寧心安神之功效，是治療快速性心律失常的臨床經(jīng)驗(yàn)加減方。為有效控制該制劑的質(zhì)量，筆者對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究——采用薄層色譜法（TLC）鑒別制劑中黃連和青蒿，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其中青蒿素的含量。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AV412型電子分析天平、CP2250型電子分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；LC-600B型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

青連寧心膠囊（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20150518、20150524、20150530，規(guī)格：0.3 mg/粒）；青蒿素對(duì)照品（批號(hào)：100202-201004，純度：98.8%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15010411）、黃連對(duì)照藥材（批號(hào)：120913-200407）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃連 取本品內(nèi)容物0.25 g，研細(xì)，加甲醇25 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的對(duì)照品溶液。再取黃連對(duì)照藥材0.25 g，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按青連寧心膠囊處方和工藝制備缺黃連的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][1]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V/V）為展開(kāi)劑，置于濃氨液預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

圖1 黃連的薄層色譜圖1.對(duì)照品；2.對(duì)照藥材；3～5.供試品；6.陰性對(duì)照Fig 1 TLC chromatograms of Coptis chinensis1.reference substance；2.control medicinal herb；3-5.test samples；6.negative control

2.1.2 青蒿 取本品內(nèi)容物3 g，加石油醚（60～90℃）50 ml，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)诱和?0 ml使溶解，加20%乙腈溶液振搖提取3次，每次10 ml，合并乙腈溶液，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇0.5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取青蒿素對(duì)照品適量，加95%乙醇制成青蒿素質(zhì)量濃度為1 mg/ml的對(duì)照品溶液。按青連寧心膠囊處方和工藝制備缺青蒿的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（4∶5，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以含2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖2。

圖2 青蒿的薄層色譜圖1.對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 1 TLC chromatograms ofArtemisia carvifolia1.reference substance；2-4.test samples；5.negative control

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（45∶55，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備[2-3]精密稱取青蒿素對(duì)照品5.62 mg，置于5 ml量瓶中，加95%乙醇溶解并定容，得青蒿素對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加0.2%氫氧化鈉溶液4 ml，搖勻，置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加0.08 mol/L醋酸溶液定容，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約1.53 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加95%乙醇50 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，得供試品溶液貯備液；精密量取上述供試品貯備液2 ml，置于10 ml量瓶中，加0.2%氫氧化鈉溶液4 ml，搖勻，于50℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加0.08 mol/L醋酸溶液定容，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按青連寧心膠囊處方和工藝制備缺青蒿的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖3。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以青蒿素峰計(jì)≥3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5。

圖3 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.青蒿素Fig 3 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.artemisinin

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別置于10 ml量瓶中，加95%乙醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為5.62、11.24、22.48、33.72、56.2 μg/ml的系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以青蒿素質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得青蒿素回歸方程為y＝10.167x－14.845（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，青蒿素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5.62～56.2 μg/ml。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，青蒿素峰面積的RSD＝0.59%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150518）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，青蒿素峰面積的RSD＝0.44%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20150518）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，青蒿素峰面積的RSD＝0.61%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：20150518）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的青蒿素對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

青蒿素是一種新型倍半萜內(nèi)酯類化合物，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)青蒿中含有抗瘧成分青蒿素，目前青蒿素的測(cè)定方法尚未收錄至《中國(guó)藥典》，由于青蒿素沒(méi)有共軛結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，所以給測(cè)定帶來(lái)了困難。已有文獻(xiàn)報(bào)道了采用多種方法測(cè)定青蒿素含量，如薛洪寶等[4]用紫外和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定青蒿中6種成分，結(jié)果除了青蒿素外，其他5種成分紫外檢測(cè)比蒸發(fā)光散射檢測(cè)靈敏度高；周翱翱等[5]用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定青蒿中青蒿素的含量；張東等[6]用HPLC-紫外吸收光譜（UV）-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定青蒿中的青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量；黃宇等[7]用碘量法測(cè)定黃花蒿中青蒿素的含量；周濃等[8]用紫外分光光度法測(cè)定重慶酉陽(yáng)縣7份不同產(chǎn)地黃花蒿；丁小莉等[9]通過(guò)比較UV和HPLC法測(cè)定青蒿中青蒿素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPLC法測(cè)定青蒿素較為準(zhǔn)確，UV法不宜單獨(dú)用于青蒿素的含量分析。

HPLC法能有效地將青蒿素和青蒿素類似物分離，排除干擾，精密度、穩(wěn)定性均較好。青蒿素只有在205 nm波長(zhǎng)處有末端吸收。本試驗(yàn)先用未衍生化的方法測(cè)定青蒿素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇等溶劑對(duì)青蒿素吸收峰有較大影響。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素檢測(cè)方法還有柱前衍生和柱后衍生[10]，通過(guò)試驗(yàn)筆者最后確定采用柱前衍生化法測(cè)定青蒿素含量。查閱文獻(xiàn)[11-13]發(fā)現(xiàn)，青蒿素能與堿發(fā)生反應(yīng)，生成Q292，在292 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但是Q292不穩(wěn)定，且反應(yīng)后生成的無(wú)機(jī)堿會(huì)對(duì)色譜柱造成損害，而Q292在pH5～6條件下易轉(zhuǎn)化為化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的Q260。故確定以衍生化HPLC法（檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm）測(cè)定青蒿素的含量。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于青連寧心膠囊的質(zhì)量控制。

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Study on the Quality Standard of Qinglian Ningxin Capsule

SI Xixi1，SUN Hongsheng2，CAO Guangshang2，CHEN Qianqian1，LIU Dan1（1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Qinglian ningxin capsule.METHODS：TLC was adopted for the qualitative identification of Coptis chinensis and Artemisia carvifolia.HPLC was used for the content determination of artemisinin：column was Diamonsil C18with mobile phase of methanol-phosphate buffer solution（45∶55，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 260 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The TLC spots of C. chinensis and A.carvifolia were clear and well separated，negative control without interference.The linear range of artemisinin was 5.62-56.2 μ g/ml（r＝0.999 4）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；recovery was 97.46%-99.72%（RSD＝0.75%，n＝6）.CONCLUSIONS：The satandard can be used for the quality control of Qinglian ningxin capsule.

Qinglian ningxin capsule；Artemisinin；HPLC；TLC；Quality standard

R917；R927

A

1001-0408（2016）33-4707-03

2015-12-01

2016-03-07）

（編輯：張 靜）

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014GGH219001）

＊碩士研究生。研究方向：中藥制劑新劑型新技術(shù)。E-mail：810700090@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥制劑新劑型新技術(shù)。電話：0531-82929059。E-mail：shs7777@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.33