雪松松針總皂苷的超聲提取工藝優(yōu)選及體外抗腫瘤活性研究Δ

李 師，雷艷萍，石曉峰，#，劉東彥，王斌利，張莉霞[.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，蘭州 7000；2.北京中醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，北京 00029；.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所，蘭州 70050]

雪松松針總皂苷的超聲提取工藝優(yōu)選及體外抗腫瘤活性研究Δ

李 師1，2＊，雷艷萍1，石曉峰1，3#，劉東彥3，王斌利1，張莉霞1[1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，蘭州 730030；2.北京中醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，北京 100029；3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所，蘭州 730050]

目的：優(yōu)選雪松松針總皂苷的超聲提取工藝，并考察其體外抗腫瘤活性。方法：采用紫外分光光度法測定雪松松針總皂苷的含量。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間為因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行試驗，以雪松松針總皂苷含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，對雪松松針總皂苷的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。考察所制雪松松針總皂苷對人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌MKN45細(xì)胞增殖的影響，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果：優(yōu)選工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，液料比13∶1，提取2次、每次65 min；以此工藝所得雪松松針總皂苷平均含量為6.693 mg/g，與預(yù)測值6.508 mg/g的相對誤差為2.84%。雪松松針總皂苷對A549、HepG2、MKN45細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且呈明顯的濃度依賴性，IC50分別為（63.98±6.79）、（154.91±10.20）、（176.32±14.26）μg/ml。結(jié)論：優(yōu)選的雪松松針總皂苷的超聲提取工藝合理、可行；其對A549、HepG2、MKN45細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，其中對A549細(xì)胞作用最為明顯。

雪松松針；總皂苷；超聲提取工藝；Box-Behnken響應(yīng)面法；抗腫瘤活性；體外

雪松[Cedrus deodara（Roxb.）G.Don.]是松科（Pianaceae）植物雪松屬（Cedrus trew）樹種的泛稱，該屬共有4種，包括雪松（C.deodara）、黎巴嫩雪松（C.libani）、短葉雪松（C.brevifolia）和北非雪松（C.atlantica），間斷地分布在喜馬拉雅山、亞洲西部（黎巴嫩、敘利亞和土耳其）、塞浦路斯及北非（摩洛哥和阿爾及利亞）[1]。其針葉藥用歷史悠久，主要化學(xué)成分為黃酮類、苯丙素類、皂苷類、甾體類、多糖類及針葉膠等[2-3]。

皂苷是苷元為三萜或甾體類化合物的一類糖苷，主要分布于陸地高等植物中，也少量存在于海星和海參等海洋生物中。對皂苷的研究主要集中在人參皂苷、柴胡皂苷、三七皂苷、絞股藍(lán)總皂苷等，該類化合物具有多種生物活性，也具有抗腫瘤的作用[4-7]。然而有關(guān)雪松松針皂苷類化合物的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)雪松松針總?cè)圃碥仗崛」に囇芯康膱蟮繹8]。筆者前期通過對雪松松針提取物體內(nèi)抗腫瘤的實驗研究，證實了雪松松針醇提取物對H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠具有一定的抗腫瘤活性。為了得到高純度雪松松針總皂苷并探討其抗腫瘤功效，本實驗擬采用紫外-可見分光光度法，以人參皂苷Rb1為對照品，建立雪松松針總皂苷的含量測定方法；采用單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面法對雪松松針總皂苷的超聲提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；采用CCK-8法，選用人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株HepG2及人胃癌細(xì)胞株MKN45進(jìn)行體外增殖抑制試驗，以期為雪松松針的抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-240紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；AE260萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；CP225D十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；X-mark酶標(biāo)儀（美國Bio Rad公司）；TDZ4-WS臺式低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb1對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14032301，純度：≥98%）；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；McCoy’s 5A Medium培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號：20150417）；四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號：JV872）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

雪松松針于2012年6月采自甘肅省蘭州市，經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院何福江研究員、石長栓副研究員鑒定為松科雪松屬植物雪松[Cedrus deodara（Roxb.）G.Don.]的松針。

1.4 細(xì)胞株

人胃癌MKN45細(xì)胞株、人肺癌A549細(xì)胞株、人肝癌HepG2細(xì)胞株均由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 準(zhǔn)確稱取粉碎過20目篩的雪松松針粉末1.00 g，置于50 ml錐形瓶中，加入70%乙醇溶液20 ml，超聲（160 W、40 kHz）提取2次，每次1 h，合并2次提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，再加入蒸餾水30 ml充分溶解，水液經(jīng)石油醚萃取（50 ml×2次）后，再用水飽和正丁醇溶液萃取（50 ml×2次），然后合并正丁醇萃取液。正丁醇萃取液經(jīng)氨試液充分洗滌（100 ml×2次）后，再用正丁醇飽和水溶液洗滌（100 ml×2次），最后減壓回收正丁醇，殘渣用甲醇溶解并定容至25 ml量瓶中，即得。

2.1.2 人參皂苷Rb1對照品溶液 精密稱取人參皂苷Rb1對照品5.0 mg，置于10 ml量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度；吸取2.5 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為50μg/ml的人參皂苷Rb1對照品溶液。

2.2 總皂苷含量測定

2.2.1 檢測波長的選擇 供試品溶液和人參皂苷Rb1對照品溶液經(jīng)5%香草醛-冰醋酸和高氯酸（1∶4）混合液處理后顯色，在300～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果在540 nm波長處有最大吸收，故本試驗將540 nm作為檢測波長。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取人參皂苷Rb1對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 ml，分別置于10 ml具塞試管中，于80℃水浴中揮干溶劑，加入新制備的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml和高氯酸溶液0.8 ml，搖勻，密塞，80℃恒溫水浴加熱15 min后，置冰水浴冷卻20 min，然后各加入冰醋酸6 ml，搖勻，靜置10 min。在540 nm波長下，以空白試劑為參比測定吸光度。以人參皂苷Rb1含量（x，μg）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝0.003 4x+0.027 7（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1質(zhì)量在20～140μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取人參皂苷Rb1對照品溶液1.20 ml，共6份，按照“2.2.2”項下方法操作，測得溶液吸光度分別為0.241、0.240、0.240、0.242、0.241、0.241，RSD為0.31%（n＝6）。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液0.2 ml，按照“2.2.2”項下方法操作，顯色10 min后，室溫放置0、5、10、15、20、25、30、35 min后分別測定。測得吸光度分別為0.192、0.191、0.191、0.190、0.192、0.192、0.191、0.189，RSD為0.56%（n＝8）。結(jié)果表明，供試品溶液顯色反應(yīng)在35 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共6份，按“2.1.1”項下方法操作平行制備6份供試品溶液，再分別精密吸取供試品溶液各0.25 ml，按照“2.2.2”項下操作方法測定吸光度。結(jié)果測得吸光度分別為0.234、0.230、0.236、0.231、0.232、0.228，其平均值和RSD分別為0.232和1.23%（n＝6）。結(jié)果表明，該操作方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末0.50 g，共6份，分別加入人參皂苷Rb1對照品30μg，按“2.1.1”項下方法操作平行制備6份供試品溶液，然后分別精密吸取各供試品溶液0.25 ml，按照“2.2.2”項下操作方法測定吸光度，計算含量及回收率。結(jié)果，其平均回收率和RSD分別為96.97%和1.96%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.2.7 樣品含量測定 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共3份，按“2.1.1”項下方法操作制備供試品溶液，然后分別精密吸取各供試品溶液0.25 ml，按照“2.2.2”項下操作方法測定吸光度，計算含量。結(jié)果，雪松松針總皂苷的平均含量為5.958 mg/g，RSD為0.74%（n＝3）。

2.3 單因素試驗考察提取工藝

對雪松松針總皂苷超聲提取過程中的4個影響因素（乙醇濃度、液料比、提取時間、提取次數(shù)）進(jìn)行單因素試驗。

2.3.1 乙醇濃度對雪松松針總皂苷含量的影響 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共6份，分別以40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇作為提取溶劑，液料比20∶1，超聲提取2次，每次60 min。然后按“2.1.1”項下方法操作制備供試品溶液，再分別精密吸取各供試品溶液0.2 ml，按“2.2.2”項下操作方法測定吸光度，并計算雪松松針總皂苷的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對雪松松針總皂苷提取量的影響

Fig 1 The effects of ethanol volume fraction on the content of TSPNCD

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，雪松松針中總皂苷的含量也逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，總皂苷的含量達(dá)到最大值；之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總皂苷的含量反而下降。究其原因可能是由于高體積分?jǐn)?shù)乙醇對脂溶性成分提取量增加，而對皂苷提取量降低。故本試驗選擇70%乙醇作為提取溶劑。

2.3.2 液料比對雪松松針總皂苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共8份，以70%乙醇作為提取溶劑，液料比分別為5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1、18∶1、20∶1、25∶1，超聲提取2次，每次60 min。然后按“2.1.1”項下方法操作制備供試品溶液，再分別精密吸取各供試品溶液0.2 ml，按“2.2.2”項下操作方法測定吸光度，并計算雪松松針總皂苷的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對雪松松針總皂苷提取量的影響

Fig 2 The effects of solvent-material ratio on the content of TSPNCD

由圖2可知，隨著液料比的增大，雪松松針總皂苷的提取量逐漸增加，當(dāng)液料比為10∶1時總皂苷的提取量達(dá)到最大值；之后隨著液料比的增大，總皂苷的提取量變化不大，逐漸趨于平衡狀態(tài)。故本試驗選擇液料比為10∶1較為適宜。

2.3.3 提取時間對雪松松針總皂苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共6份，以70%乙醇作為提取溶劑，以液料比為10∶1，超聲提取時間分別定為15、30、45、60、75、90 min，提取2次。然后按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再分別精密吸取各供試品溶液0.2 ml，按“2.2.2.”項下操作方法測定吸光度，并計算雪松松針總皂苷的含量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著提取時間的增加，雪松松針中總皂苷的提取量逐漸增大，當(dāng)提取時間為60 min時總皂苷的提取量達(dá)到最大值；之后隨著提取時間的增加，總皂苷的含量并沒有發(fā)生明顯的變化。故確定本試驗的超聲提取時間為60 min。

圖3 提取時間對雪松松針總皂苷提取量的影響

Fig 3 The effects of extraction time on the content of TSPNCD

2.3.4 提取次數(shù)對雪松松針總皂苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取雪松松針粉末1.00 g，共3份，以70%乙醇作為提取溶劑，液料比為10∶1，超聲提取時間為60 min，提取3次。分次按“2.1.1”項下方法操作制備供試品溶液，然后分別精密吸取各供試品溶液0.2 ml，按“2.2.2”項下操作方法測定吸光度，計算雪松松針總皂苷的含量。結(jié)果，提取第1次測得含量分別為38.03、37.15、35.97μg/g，平均含量為37.05μg/g；提取第2次測得含量分別為27.44、25.38、26.56μg/g，平均含量為26.46μg/g；提取第3次后均未檢測到雪松松針總皂苷。結(jié)果表明，在提取2次后即可將雪松松針中的總皂苷提取完全，故本試驗中確定提取次數(shù)為2次。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 方案設(shè)計及試驗結(jié)果 參考單因素試驗結(jié)果及文獻(xiàn)方法[9-11]，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1，%）、液料比（X2，ml/g）、提取時間（X3，min）為因素，采用Box-Behnken法進(jìn)行3因素3水平的試驗設(shè)計，以雪松松針總皂苷含量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。因素與水平見表1，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型的建立及顯著性分析 利用Design-Expert 8.0.5軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸統(tǒng)計分析。得二元多項回歸模型為Y＝－58.98+1.20X1－0.06X2+0.69X3+3.70×10－3X1X2+1.08×10－3X1X3+ 8.10×10－3X2X3－9.05×10－3X12－0.027X22－6.77×10－3X32，R2＝0.994 2，表明回歸方程擬合度良好，結(jié)果可靠。方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明試驗建立的模型極顯著；失擬項P＝0.079 9＞0.05，沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)沒有異常點；一次項X1、X2、X3和二次項X12、X22、X32均對試驗結(jié)果有極顯著影響（P＜0.000 1）；BC對試驗結(jié)果有極顯著影響（P＜0.000 1），X1X2對試驗結(jié)果有非常顯著的影響（P＜0.01），X1X3對試驗結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），這說明考察因素對試驗結(jié)果存在交互作用。模型的校正系數(shù)R2＝0.994 2，表明回歸方程擬合度良好，可以用此模型分析和預(yù)測雪松松針總皂苷的提取工藝。

2.4.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高圖，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析超聲提取各因素對雪松松針總皂苷含量的影響，結(jié)果見圖4。

等高線的形狀可以反映交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。由圖4可以看出，各因素間交互作用顯著，作用大小排列依次為X2X3＞X1X2＞X1X3。由響應(yīng)面圖可知，超聲提取時間對雪松松針總皂苷的含量影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；乙醇濃度和料液比對雪松松針中總皂苷含量的影響顯著，表現(xiàn)為曲線平滑。

2.4.4 驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.5軟件對回歸方程進(jìn)行求解，得到雪松松針總皂苷的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72.26%，液料比13.39∶1，超聲提取2次、每次64.77 min。考慮到實際試驗條件的可操作性，將工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，液料比13∶1，超聲提取2次、每次65 min。在此最優(yōu)提取工藝條件下，取10 g樣品進(jìn)行工藝驗證試驗，平行5次，計算得雪松松針中總皂苷的平均含量為6.693 mg/g（RSD＝2.84%，n＝5），與預(yù)測值6.508 mg/g相差0.185 mg/g，相對誤差為2.84%，表明優(yōu)選工藝條件準(zhǔn)確、可靠。

2.5 雪松松針總皂苷對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

圖4 因素和響應(yīng)值關(guān)系的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 4 Contour map and response surface plot of the relationship of factors with response value

方法[12-15]進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、消化并計數(shù)。分別取對數(shù)生長期的人胃癌MKN45細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后離心，除去上清液，用培養(yǎng)基（A549、HepG2細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基，MKN45細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基）稀釋成5×104個/ml的細(xì)胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為試驗組、陰性對照組和空白對照組，其中A549細(xì)胞試驗組分別加入終質(zhì)量濃度為10、20、40、80、120μg/ml的雪松松針總皂苷溶液，HepG2和MKN45細(xì)胞試驗組分別加入終質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200μg/ml的雪松松針總皂苷溶液。每個質(zhì)量濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)1個平行空白對照孔，陰性對照孔則加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。然后將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，各孔加入CCK-8溶液10μl，混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率＝[1－（A試驗組－A空白對照組）/（A陰性對照組－A空白對照組）]×100%。應(yīng)用SPSS 19.0軟件求其半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見圖5。

結(jié)果顯示，雪松松針總皂苷對人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌MKN45細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，呈明顯的濃度依賴關(guān)系，抑制作用大小依次為A549＞HepG2＞MKN45，IC50分別為（63.98±6.79）、（154.91±10.20）、（176.32±14.26）μg/ml；其中雪松松針總皂苷對A549細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為120μg/ml時，抑制率達(dá)71.29%。

圖5 雪松松針總皂苷對不同腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用Fig 5 Inhibitory effects of TSPNCD on in vitro proliferation of different tumor cells

3 討論

3.1 雪松松針總皂苷的提取工藝優(yōu)化

許文鳳等[16]采用正交試驗對雪松松針總?cè)圃碥盏奶崛」に囘M(jìn)行了研究，得到的最佳提取工藝條件為浸提溫度70℃、浸提時間2 h、料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，該工藝不但費時且得率較低。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對雪松松針總皂苷的超聲提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并通過對回歸方程的分析，得到了其最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%、液料比13∶1、提取2次、每次提取65 min。在此條件下測得的總皂苷含量為6.693 mg/g，與模型預(yù)測值相接近，說明此方法具有較高的精確度和預(yù)測性，經(jīng)驗證工藝合理、可行。

3.2 雪松松針總皂苷的體外抗腫瘤活性

本試驗采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖，與較傳統(tǒng)的MTT法比較具有操作簡便、無損失、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點[17]。結(jié)果顯示，雪松松針總皂苷對人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌MKN45細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，其中尤以對A549細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)；當(dāng)雪松松針總皂苷質(zhì)量濃度為120μg/ml時，增殖抑制率達(dá)71.29%。這提示雪松松針總皂苷在治療人肺癌方面具有較好的應(yīng)用前景。然而，有關(guān)雪松松針總皂苷抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究尚未進(jìn)行，有待在后續(xù)研究中完成。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄭萬，傅立國.中國植物志：第七卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：167.

[2] 白朝輝，石曉峰，劉東彥，等.雪松松針的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥師，2012，15（12）：1 791.

[3] 李師，劉東彥，石曉峰，等.雪松松針正丁醇部位的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2014，45（18）：2 602.

[4] 權(quán)愷，劉群.人參皂苷抗癌活性的最新研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2015，28（4）：427.

[5] 吳正平.柴胡皂苷的藥理研究進(jìn)展[J].宜春學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，29（2）：126.

[6] 楊琳，林萬程，施家樂.三七總皂苷藥理作用的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2014，18（5）：963.

[7] 李露，范紅艷，戴婷，等.絞股藍(lán)總皂苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2015，36（2）：147.

[8] 楊安平，柯俊東.響應(yīng)曲面法優(yōu)選糞箕篤總皂苷的提取工藝[J].天津藥學(xué)，2015，27（2）：6.

[9] 廖紅丹.響應(yīng)面法優(yōu)化茯苓苦瓜膠囊粗多糖和總皂苷的綜合提取工藝[J].中國藥房，2016，27（1）：92.

[10] 韋蒙，許新恒，李俊龍，等.滇重樓莖葉總皂苷提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（10）：13 794.

[11] 李玉澤，李真，張東東，等.響應(yīng)面法優(yōu)選竹根七總皂苷提取工藝[J].中南藥學(xué)，2015，13（8）：811.

[12] 劉明健，瞿鼎，陳彥，等.丁酰半乳糖酯修飾的薏苡仁組分微乳的制備及其體外抗腫瘤活性研究[J].中草藥，2015，46（18）：2 696.

[13] 姜程曦，宋嬌，林良義，等.以成纖維細(xì)胞生長因子受體1為靶點的姜黃素類似物的抗腫瘤活性研究[J].中草藥，2015，46（16）：2 434.

[14] 李輝敏，姜登釗，殷嫦嫦.刺頭復(fù)葉耳蕨總提取物與總黃酮體外抗腫瘤活性的比較研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015，32（9）：1 037.

[15] 嚴(yán)銘銘，吳程彥，尉忠賢，等.黃花草木犀總皂苷體外抗腫瘤作用研究[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（2）：191.

[16] 許文鳳，王文君，徐明生，等.雪松松針總?cè)圃碥盏奶崛」に嚨难芯縖J].食品工業(yè)科技，2011，32（6）：312.

[17]熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞活性之測試條件比較[J].激光生物學(xué)報，2007，16（5）：559.

Optimization of the Ultrasonic Extraction Technology of Total Saponins from Pine Needle of Cedrus deodara and Study on Its in vitro Antitumor Activity

LI Shi1，2，LEI Yanping1，SHI Xiaofeng1，3，LIU Dongyan3，WANG Binli1，ZHANG Lixia1（1.School of Pharmacy，Gansu University of TCM/Key Laboratory of Chemistry and Quality of TCM of the College of Gansu Province，Lanzhou 730030，China；2.School of Pharmacy，Beijing University of TCM，Beijing 100029，China；3.Institute of Materia Medica，Gansu Academy of Medical Science，Lanzhou 730050，China）

OBJECTIVE：To optimize the ultrasonic extraction technology of total saponins from pine needles of Cedrus deodara（TSPNCD），and to investigate its in vitro antitumor activity.METHODS：The content of TSPNCD was determined by UV spectrophotometry.Based on single factor test，ethanol volume fraction，solvent-material ratio and extraction time were selected as influential factors during ultrasonic extraction.According to Box-Behnken design，using the content of TSPNCD as response value，response surface analysis was conducted and used to optimize the ultrasonic extraction technology of TSPNCD.The effects of TSPNCD on the proliferation of human lung cancer A549 cells，human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and human gastric cancer MKN45 cells were detected，and IC50of them were calculated.RESULTS：Optimal technology was that extraction solvent was 73%ethanol；solvent-material ratio was 13∶1；ultrasonic extraction times was twice，each time for 65 min.Under the above conditions，the average content of TSPNCD reached 6.693 mg/g，and relative error between it and predicted value（6.508 mg/g）was 2.84%.TSPNCD inhibited the growth of A549 cells，HepG2 cells and MKN45 cells in a dose-dependent manner，with the IC50values of（63.98±6.79），（154.91±10.20），（176.32±14.26）μg/ml，respectively.CONCLUSIONS：The ultrasonic extraction technology was verified as reasonable and feasible.TSPNCD has certain inhibitory effect on the proliferation of A549 cells，HepG2 cells and MKN45 cells，especially for A549 cells.

Pine needles of Cedrus deodara；Total saponins；Ultrasonic extraction technology；Box-Behnken response surface methodology；Antitumor activity；in vitro

R284.2

A

1001-0408（2016）31-4406-05

2016-05-02

2016-07-26）

（編輯：林 靜）

甘肅省科技支撐計劃項目（No.甘財教〔2012〕197號）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（No.2014-RC-62）；甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室開放基金項目（No.zzy-2015-02）

＊博士研究生。研究方向：中藥化學(xué)及中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0931-2302664。E-mail：736663549@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：中藥化學(xué)及中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0931-2302664。E-mail：shixiaofeng2005@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.26