均勻設計法結合動態優化法優選復方獨一味凝膠貼膏的提取工藝

王 森，歐水平，袁 濤（1.遵義醫學院藥學院，貴州遵義 5600；2.遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義 5600；.江西青峰藥業有限公司，江西贛州 41008）

均勻設計法結合動態優化法優選復方獨一味凝膠貼膏的提取工藝

王 森1＊，歐水平2#，袁 濤3（1.遵義醫學院藥學院，貴州遵義 563003；2.遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義 563003；3.江西青峰藥業有限公司，江西贛州 341008）

目的：優選復方獨一味凝膠貼膏的提取工藝。方法：以浸膏得率、5種指標成分（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷、8-O-乙酰山梔苷甲酯、2′，4′-二羥基查耳酮）提取率和純度（5種指標成分含量之和/浸膏得率）為評價指標，以乙醇用量、乙醇體積分數、提取時間為考察因素，獲得均勻設計優化工藝參數后，進一步采用動態優化法優化提取時間。結果：均勻設計優化工藝為8倍量90%乙醇回流提取2次，每次1 h；優化后的浸膏得率為24.37%，5種指標成分提取率依次為0.10%、0.51%、1.65%、0.74%、0.19%，純度為13.11%。動態優化后提取時間縮短為第1次40 min、第2次30 min，浸膏得率為24.58%，5種指標成分提取率依次為0.10%、0.52%、1.78%、0.75%、0.31%，純度為14.08%。結論：均勻設計優選的提取工藝合理、穩定，提取率高；動態優化法可進一步縮短提取時間、降低耗能、節約生產成本。

獨一味；凝膠貼膏；浸膏得率；指標成分；均勻設計；動態優化法

復方獨一味凝膠貼膏由獨一味、白花秦艽、鐮形棘豆、唐古特烏頭組方而成，有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛之功效，對痛風性關節炎有良好療效[1]。本品原為藏醫經驗方，臨床以粉末調敷，有效成分透皮吸收有限，使用不便，限制了臨床應用。本研究將處方藥味進行提取后制成凝膠貼膏，以擴大用藥范圍、提高順應性。方中獨一味中所含環烯醚萜苷類成分是主要活性成分，代表成分為山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯，有鎮痛、抗炎、止血等作用[2-3]；白花秦艽所含環烯醚萜苷類成分是其主要活性成分，代表成分為馬錢苷酸、龍膽苦苷，有鎮痛、抗炎等作用[4]；鐮形棘豆中黃酮類成分主要有抗炎止痛、清熱解毒等藥理作用，代表成分為2′，4′-二羥查耳酮[5]。考慮獨一味、白花秦艽均含環烯醚萜苷類成分，擬采用合提方式。但環烯醚萜苷類含有半縮醛結構，穩定性差，容易在稀堿環境下發生結構異構化，如龍膽苦苷極易轉化為龍膽堿[6]，故將方中獨一味、鐮形棘豆、白花秦艽混合提取；而唐古特烏頭含生物堿類成分，宜分開單獨提取[7-8]。本試驗選用浸膏得率，以及山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯、馬錢苷酸、龍膽苦苷、2′，4′-二羥基查耳酮等5種指標成分的提取率和純度為評價指標，以優化提取工藝，為研制性質穩定、工藝可行的復方獨一味凝膠貼膏奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A型在線脫氣機、G1311A型四元泵、G1316A型柱溫箱、G1314A型可見波長檢測器（美國安捷倫公司）；BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥材、藥品與試劑

獨一味、鐮形棘豆、白花秦艽藥材均由西藏藏醫學院提供，經遵義醫學院藥劑學教研室王森副教授鑒定符合2015年版《中國藥典》相關規定；馬錢苷酸（批號：L-005-121002）、山梔苷甲酯（批號：M-0008-13111）、龍膽苦苷（批號：S-013-120910）、8-O-乙酰山梔苷甲酯（批號：120809）對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度：≥98%）；2′，4′-二羥基查耳酮對照品（天津阿法埃莎化學有限公司，批號：MFCD00180050，純度：≥98%）；乙腈、磷酸等均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 5種指標成分的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷、8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 ml含馬錢苷酸0.502 mg、山梔苷甲酯0.536 mg、龍膽苦苷0.818 mg、8-O-乙酰山梔苷甲酯0.480 mg的混合溶液，搖勻，即得對照品溶液1。取2′，4′-二羥基查耳酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 ml含2′，4′-二羥基查耳酮0.122 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液2。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.3”～“2.6”項下制備的獨一味、鐮形棘豆、白花秦艽混合提取液1 ml，置于10 ml量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）（用于同時測定馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯），梯度洗脫[9]（0～15 min，9%A；15～18 min，9%～11%A；18～28 min，11%A；28～35 min，11%～18%A）；乙腈-0.05%磷酸水（60∶40，V/V，用于測定2′，4′-二羥基查耳酮）；柱溫30℃；流速1.0 ml/min；檢測波長235 nm（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯）、365 nm（2′，4′-二羥基查耳酮）；進樣量：20 μl。取“2.1.1”“2.1.2”項下溶液進樣測定，理論板數按5種指標成分峰計不低于3 000，分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液1；B.供試品溶液1（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯）；C.對照品溶液2；D.供試品溶液2（2，′4′-二羥基查耳酮）；1.馬錢苷酸；2.山梔苷甲酯；3.龍膽苦苷；4.8-O-乙酰山梔苷甲酯；5.2，′4′-二羥基查耳酮Fig 1 HPLC chromatogramsA.standard solution 1；B.sample solution 1（loganin acid，shanzhiside methyl ester，gentiopicroside，8-O-acetyl shanzhiside methyl ester）；C. standard solution 2；D.sample solution 2（2′，4′-dihydroxychalcone）；1. loganin acid；2.shanzhiside methyl ester；3.gentiopicroside；4.8-O-acetyl shanzhiside methyl ester；5.2，′4′-dihydroxychalcone

2.1.4 線性關系考察 精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml對照品溶液1，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml對照品溶液2，分別置于5 ml量瓶中，蒸餾水定容，制得不同濃度系列對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，線性方程與線性范圍見表1。

表1 指標成分線性方程與線性范圍Tab 1 The linear equation and range of marker components

2.1.5 精密度、穩定性、重復性、回收率試驗 按相關方法操作。結果，精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均未超過2.33%（n＝6），供試品在15 h內穩定；平均加樣回收率在98.91%～100.32%之間（RSD≤2.62%，n＝6）。

2.2 浸膏得率測定

精密量取“2.1.2”項下供試品溶液20 ml，置于105℃已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥10 h，置于干燥器中冷卻至室溫，迅速稱定干膏質量并計算浸膏得率。浸膏得率（%）＝干膏質量（g）×提取液總體積（ml）/[藥材質量（g）×20 ml]×100%。

2.3 單因素考察

根據預試驗，采用回流法提取方法，單因素考察提取溶劑、次數、時間對浸膏得率和提取物中5種指標成分提取率及純度（5種指標成分含量之和/浸膏得率×100%）的影響。

2.3.1 提取溶劑 按處方比例稱取藥材獨一味、鐮形棘豆、白花秦艽粉末共25.0 g，共4份。分別加入10倍量蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取2次，每次提取1 h，合并提取液，濾過，加相應溶劑定容至500 ml，即得混合提取液，按“2.1.3”項下條件進樣測定，結果見表2。

表2 提取溶劑考察結果（%%）Tab 2 The results of solvent extraction test（%%）

結果表明，與水和低體積分數乙醇比較，高體積分數乙醇可總體提高指標成分提取率，但使用95%乙醇會降低浸膏得率，故擬以70%乙醇為均勻試驗考察的中間水平。

2.3.2 提取次數 稱取“2.3.1”項下藥材粉末25.0 g，加入10倍量70%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次1 h，將每次提取的提取液分別倒出，過濾，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，結果見表3（表中“＊”表示5種指標成分含量之和/3次浸膏得率之和×100%）。

表3 提取次數考察結果（%%）Tab 3 The results of extraction times test（%%）

結果表明，經2次提取后，浸膏得率、指標成分的提取率及純度均較高，為兼顧提取效率和成本，確定提取次數為2次。

2.3.3 提取時間 稱取“2.3.1”項下藥材粉末25.0 g，共3份，加入10倍量70%乙醇溶液，分別加熱回流提取1、1.5、2 h，提取2次，過濾，得混合提取液后按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，結果見表4。

表4 提取時間考察結果（%%）Tab 4 The results of extraction time test（%%）

結果表明，隨著提取時間的增加，5種指標成分的提取率未顯著增加，而浸膏得率呈上升趨勢，純度呈現先增后降的趨勢，故需對提取時間進行進一步優化。

2.4 均勻設計優化

根據單因素考察結果，以一定體積分數乙醇為提取溶劑，提取次數為2次，選擇溶劑倍數（X1）、乙醇體積分數（X2）、提取時間（X3，h）為考察因素，以提取物的浸膏得率、5種指標成分的提取率及純度為評價指標，采用U6（64）均勻設計表安排試驗，試驗設計及結果見表5。

表5 均勻試驗設計與結果（%%）Tab 5 The design and results of uniform design（%%）

以5種指標成分的總提取率（Y）為綜合評價指標，采用JMP Pro 10統計軟件進行多元回歸分析[7-8]。結果Y＝0.122 1－0.001 9X1+0.055 9X2－0.015 04X3－0.055 5×（X2－0.7）×（X3－1.5），r2＝0.999 4。方差分析結果見表6。

表6 方差分析結果Tab 6 Results of variance analysis

注：F0.1（2，2）＝9.00，F0.05（2，2）＝19.00

Note：F0.1（2，2）＝9.00，F0.05（2，2）＝19.00

結果表明，在均勻設計試驗條件下，擬合的模型顯著，對提取工藝的影響依次為X2＞X3＞X1＞X2X3，Y隨X1、X3的增大而減小，隨X2的增大而增大。其中X2的影響最顯著，X1、X3、X2X3的影響達到顯著水平，X2與X3有一定交互作用。相對X3而言，X2對Y的影響更顯著，X2提高至90%可顯著降低浸膏得率，提高指標成分提取率，使Y明顯提高；且X2越靠近90%，隨X3的縮短Y提高越明顯，可見X2和X3的影響規律與單因素考察結果一致，即提高乙醇濃度和縮短提取時間，有利于提高指標成分純度。

通過JMP Pro 10軟件預測刻畫器，以指標成分總純度最大化為優化意愿，預測最優提取工藝參數為8倍量90%乙醇回流提取2次，每次1 h；指標成分總純度理論預測值為14.8%，預測意愿達99.86%。

2.5 均勻設計驗證試驗

按處方比例稱取獨一味、鐮形棘豆、白花秦艽藥材粉末125.0 g，根據均勻設計優化的工藝參數提取，即得混合提取液，平行進行3次驗證試驗，結果見表7，表明均勻設計優化工藝穩定可行。

表7 工藝驗證結果（%%）Tab 7 The results of technology verification（%%）

2.6 提取時間動態優化

由均勻設計分析可知縮短提取時間可提高指標成分提取率、縮短生產周期、降低生產成本，但均勻設計試驗未考察提取時間1 h以內對試驗結果的影響。按均勻優化工藝條件提取藥材，分別在10、20、30、40、50、60 min時精密量取提取液3 ml進行含量測定，每次補足同體積的90%乙醇。提取完畢后，濾過，再加入8倍量90%乙醇，相同時間間隔取樣測定，結果見表8、表9。

表8 第1次提取各時間點指標成分含量（mg/ml）Tab 8 The contents of marker components at different time points of first extraction（mg/ml）

表9 第2次提取各時間點指標成分含量（mg/ml）Tab 9 The contents of marker components at different time points of second extraction（mg/ml）

結果表明，在2次提取過程中，隨著提取時間的延長，提取液中5種指標成分含量均先增加后減少，這可能與指標成分長時間受熱不穩定有關。故以每次提取指標成分含量達最高值的時間為優化后的提取時間，即第1次提取時間為40 min，第2次提取時間為30 min，并與均勻設計優化工藝進行比較，結果見表10。

表10 兩種提取工藝結果比較（%%）Tab 10 Comparison of two extraction technologies（%%）

結果表明，動態優化提取方法在指標成分提取率和純度方面均優于均勻設計試驗結果，且提取時間比均勻設計優化工藝節約42%，有利于提高生產效率、降低生產成本。

3 討論

中藥復方具有多成分、多靶點的特點，因此僅單一藥味或單一成分作為指標考察提取工藝，不能全面反映提取效果[8-9]。復方獨一味凝膠貼膏為藏藥復方制劑，本研究為全面兼顧復方制劑藥味和有效成分對藥理作用的貢獻，根據各藥的藥效物質基礎，結合制劑臨床應用，設計了提取工藝路線。

復方獨一味凝膠貼膏原方以粉末調敷外用，獨一味、白花秦艽、鐮形棘豆日用量約25 g。為兼顧臨床粉末調敷用藥的需求，在外用調敷粉末的基礎上進行提取，即先將3味藥材（各5 kg）粉碎成粉末調敷成相當粒度的粉末，并按處方量混合均勻，考察提取工藝設計時取樣25 g進行試驗。后期進行放大試驗（提取3味藥材共4 kg），結果浸膏得率、5種指標成分提取率與純度均較高，表明提取工藝的合理和可放大性，可為工業化大規模提取提供可靠的依據。

均勻設計和動態優化法在中藥提取中得到了廣泛應用，能夠用較少的試驗次數優選出比較科學合理的工藝[10-11]。本試驗采用均勻設計法，讓試驗點在試驗范圍內充分地“均勻分散”，使每個試驗點有更好的代表性，以較小次數的試驗獲取更好的試驗效果[12]，并采用JMP Pro 10軟件對試驗結果進行回歸建模分析[13-14]，取得了預期效果。

綜上所述，本研究均勻設計優選的提取工藝合理、穩定，提取率高；動態優化法可進一步縮短提取時間、降低耗能、節約生產成本。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of the Extraction Technology of Compound Lamiophlomis rotata Gel Plasters with Uniform Design and Dynamic Optimization Method

WANG Sen1，OU Shuiping2，YUAN Tao3（1.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；3.Jiangxi Qinfeng Pharmaceutical Co.Ltd.，Jiangxi Ganzhou 341008，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound Lamiophlomis rotata gel plasters.METHODS：With the yield of extractum，the extract rate and purity（sum of contents of 5 marker components/extract rate）of 5 marker components（loganin acid，shanzhiside methyl ester，gentiopicroside，8-O-acetyl shanzhiside methyl ester，2′，4′-dihydroxychalcone）as indexes，with ethanol amount，ethanol concentration and extraction time as factors，uniform design（UD）was used to optimize technology parameters.Then dynamic optimization extraction method（DOEM）was employed to further optimize extraction time.RESULTS：The optimum extraction conditions of UD were as follows as 8-fold 90%ethanol，extracting 2 times，1 h each time.The yield of extractum was 24.37%，and the extract rate of 5 marker components were 0.10%，0.51%，1.65%，0.74%and 0.19%，respectively；the purity of them was 13.11%.The extraction time was reduced to 40 times at first time and 30 times at second time by DOEM；the extract rates of 5 marker components were 0.10%，0.52%，1.78%，0.75%and 0.31%，respectively；the purity of them was 14.08%.CONCLUSIONS：The optimum extraction conditions of UD are reasonable and stable.DOEM can significantly reduce extraction time，consumption and production costs.

Lamiophlomis rotate；Gel plasters；Yield of extractum；Marker components；Uniform design；Dynamic optimization method

R283.6

A

1001-0408（2016）31-4439-04

2016-01-21

2016-09-13）

＊副教授，博士。研究方向：中藥新劑型新制劑。電話：0851-28642515。E-mail：wangsen912912@126.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：醫院藥學。電話：0851-28608517。E-mail：oushuiping1208@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.35