六味地黃丸對糖尿病模型大鼠血管組織中HO-1的影響Δ

呂小輝，王 喆，孫佳瑜，蔡智剛，張瑞鵬，單愛云#（.深圳市福田區中醫院，廣東深圳 580；.中南大學湘雅醫學院，長沙 400；.深圳清華大學研究院，廣東深圳 58067）

六味地黃丸對糖尿病模型大鼠血管組織中HO-1的影響Δ

呂小輝1＊，王 喆2，孫佳瑜1，蔡智剛1，張瑞鵬3，單愛云1#（1.深圳市福田區中醫院，廣東深圳 518033；2.中南大學湘雅醫學院，長沙 410013；3.深圳清華大學研究院，廣東深圳 518067）

目的：探討六味地黃丸對糖尿病模型大鼠血管中血紅素加氧酶1（HO-1）的影響。方法：將大鼠隨機分為正常組、模型組、六味地黃丸組（14 g/kg，每天ig給藥）和HO-1抑制劑鋅原卟啉（10 μmol/kg，隔日ip給藥）+六味地黃丸組（14 g/kg，每天ig給藥），每組12只。除正常組外，其余各組大鼠均ip鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型。成模后，各給藥組大鼠給予相應藥物，正常組和模型組大鼠隔日ip生理鹽水，連續4周。檢測大鼠尾動脈收縮壓（SBP）和心率；觀察六味地黃丸對苯腎上腺素（PE）刺激的胸主動脈血管環收縮反應的影響和乙酰膽堿（Ach）、硝普鈉（SNP）刺激的胸主動脈血管環舒張反應的影響；并檢測血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白的表達。結果：與正常組比較，模型組大鼠SBP升高，主動脈血管環對Ach刺激的舒張反應減弱、對PE刺激的收縮反應增強（P＜0.05）；血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，六味地黃丸組大鼠主動脈血管環對Ach刺激的舒張反應增強，對PE刺激的收縮反應減弱，且血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。與六味地黃丸組比較，聯用藥組大鼠SBP持續升高、對Ach刺激的舒張反應持續減弱（P＜0.05），血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠間比較，心率差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：六味地黃丸可改善糖尿病模型大鼠血管反應性失調，這可能與其高表達血管組織中HO-1有關。

六味地黃丸；糖尿病；血紅素加氧酶1；血管功能；大鼠

糖尿病是危害人類健康的重大疾病之一，由糖尿病繼發的脂肪代謝紊亂而引起的血管病變是其造成死亡的主要原因，早期對血管進行保護是降低心腦血管疾病發生率的主要手段[1]。我國傳統中藥六味地黃丸由熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等藥材組成，主要用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟等癥的治療。研究發現，六味地黃丸不僅對泌尿生殖系統、免疫調節系統和血液循環系統有一定調節作用，對血管損傷也有一定的保護作用[1]，但其作用的機制不甚明確。血紅素加氧酶1（HO-1）是體內血紅素代謝的限速酶，其代謝產物是重要的生理性氧自由基清除劑。HO-1是機體保護性酶，正常情況下維持一定的表達量，同時也是可誘導酶，在一定的誘導因素（如藥物、環境改變等）下可誘導其表達量的增加[2]。本實驗主要觀察六味地黃丸對糖尿病大鼠主動脈功能和血管組織中HO-1表達的影響，同時給予HO-1蛋白功能特異性拮抗劑鋅原卟啉（ZnPP），探討六味地黃丸對糖尿病大鼠血管調節功能與HO-1蛋白的相關性。

1 材料

1.1 儀器

ACCU-CHEK血糖儀（美國Roche公司）；T100聚合酶鏈式反應（PCR）儀、BioradGel Doc XR凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；CODA無創血壓儀（美國Kent公司）。

1.2 藥品與試劑

六味地黃丸（北京同仁堂科技發展股份有限公司，批號：20150415，規格：20 g/100粒）；吲哚美辛（湖北健源化工有限公司，批號：53-86-1）；苯腎上腺素（PE，湖北巨勝科技有限公司，批號：59-42-7）；乙酰膽堿（Ach，上海滬鼎科技有限公司，批號：9000-81-1）；硝普鈉（SNP，湖北帝鑫化工有限公司，批號：13755-38-9）；鏈脲佐菌素（STZ，批號：S0130）、ZnPP（批號：282820）購自美國Sigma公司；實驗所用試劑均為化學純。

1.3 動物

Wistar大鼠，48只，SPF級，♀♂各半，體質量220～260 g，購于廣東省醫學實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2013-0002]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為正常組、模型組、六味地黃丸組和ZnPP+六味地黃丸組，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠均ip STZ（50 mg/kg）誘導糖尿病模型，4 d后剪尾取血，以血糖＞16 mmol/L確定為造模成功。成模后，六味地黃丸組大鼠每天ig六味地黃丸（14 g/kg）1次，連續4周；ZnPP+六味地黃丸組大鼠每天ig六味地黃丸（14 g/kg）1次，并隔日ip ZnPP（10 μmol/kg）1次，連續4周；正常組和模型組大鼠隔日ip生理鹽水，連續4周。

2.2 血壓與心率的檢測

用大鼠無創血壓計監測尾動脈收縮壓（SBP），同時監測大鼠心率以排除心率對血壓的影響。

2.3 血管環的制備

大鼠麻醉后放血處死，開胸，取出心肺組織放入KRB緩沖液中，往液體中灌注混合氣體（95%O2+5%CO2）。仔細分離胸主動脈，剪取胸主動脈血管環，其中一段血管放入Trizol溶液中，另一段血管放入－80℃冰箱中用于檢測HO-1的表達，剩下的一段放入KRB緩沖液中用于血管張力的檢測[3]。

2.4 胸主動脈血管張力的檢測

將制備好的血管環經KRB緩沖液平衡后，加入1×10－5mol/L吲哚美辛清除環氧酶產物。將血管一端固定，另一端連接換能器，當血管環在15 min內將張力升到2 g時，每15 min換一次液，待基礎張力穩定后開始實驗。實驗結束后將血管環置于恒溫干燥箱中烘烤至質量不再變化，記錄干質量，用以標化張力。各組大鼠血管環分別給予10－6mol/L PE、Ach、SNP刺激，觀察血管環對PE的收縮反應和對Ach、SNP的舒張反應。收縮反應用每毫克血管環干質量的克張力（g/mg）表示，舒張反應結果用給血管舒張劑前、后對PE刺激后血管收縮反應的百分比表示。

供試的馬尾松毛蟲4～5齡幼蟲于2015年4月上旬采集于福建省泉州臺商投資區張坂鎮，試蟲采回后放入養蟲籠中以新鮮馬尾松針葉飼養1 d后，選取健康的幼蟲用于生物測定。

2.5 胸主動脈血管HO-1 mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法。將血管冷凍研磨后，Trizol裂解胸主動脈，提取胸主動脈總mRNA，在梯度PCR儀上反轉錄成cDNA，鑒定其完整性后進行PCR擴增。引物序列：HO-1上游引物序列為5′-CACTCTGGAG-ATGACACCTGAG-3′，下游引物序列為5′-GTGTTCCTCTGTCAGCATCACC-3′，250 bp；β-actin上游引物序列為5′-TCTGTGTGGATTGTGGCTCTA-3′，下游引物序列為5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′，250 bp。反應體系：PCR Master Mix（2×）5 μl，上、下游引物各0.2 μl，cDNA 0.6 μl，DEPC水4 μl。兩步法反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，39個循環。采用2－ΔΔct法計算目的基因的相對表達量。

2.6 胸主動脈血管HO-1蛋白表達的檢測[2]

采用Western blot法。取胸主動脈，將胸主動脈液氮冷凍后在蛋白提取液中進行研磨，低溫離心（16 873×g）15 min，取上清，制備成蛋白樣品，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度。調整各組的蛋白質上樣量（40 μg），行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，電轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶1000），4℃過夜。加入HRP標記的IgG二抗（1∶5000）孵育1 h后洗膜，加入發光液后凝膠成像。通過Image J2x軟件進行灰度值分析，以HO-1與內參β-actin條帶灰度值的比值表示HO-1的相對表達量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 六味地黃丸對大鼠尾動脈SBP與心率的影響

表1 各組大鼠尾動脈SBP和心率測定結果（±s，n＝12）Tab 1 SBP of caudal artery and heart rate of rats in each group（±s，n＝12）

表1 各組大鼠尾動脈SBP和心率測定結果（±s，n＝12）Tab 1 SBP of caudal artery and heart rate of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與六味地黃丸組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.Liuwei dihuang pills group，#P＜0.05

心率，次/min 150.24±15.32 155.65±13.56 151.21±15.68 148.16±17.91組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組SBP，mm Hg 114.45±15.21 138.57±13.45＊125.42±16.72 140.27±19.32＊#

3.2 六味地黃丸對大鼠血管張力的影響

與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈血管環對Ach刺激內皮依賴性的舒張反應減弱，而對PE刺激收縮反應增強（P＜0.05）。與模型組比較，六味地黃丸組大鼠主動脈血管環對PE刺激收縮反應減弱，對Ach刺激內皮依賴性的舒張反應增強（P＜0.05）。當給予HO-1蛋白特異拮抗劑ZnPP后，ZnPP+六味地黃丸組大鼠胸主動脈血管環對Ach刺激的舒張反應減弱，且弱于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果提示，六味地黃丸能夠降低PE對血管的收縮反應和增強Ach刺激內皮依賴性的血管舒張反應；使用ZnPP抑制劑后了反轉了六味地黃丸的作用。各組大鼠間比較，主動脈血管環對SNP內皮依賴性的舒張反應差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血管張力測定結果見表2。

表2 各組大鼠血管張力測定結果（±s，n＝12）Tab 2 The vascular tone of rats in each group（±s，n＝12）

表2 各組大鼠血管張力測定結果（±s，n＝12）Tab 2 The vascular tone of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

SNP，% 63±10 58±13 62±11 59±12組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組PE，g/mg 0.81±0.12 0.92±0.13＊0.82±0.17#0.90±0.16＊Ach，% 67±11 44±9＊58±6#32±8＊#

3.3 六味地黃丸對血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達有所增強，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，六味地黃丸組和ZnPP+六味地黃丸組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達增強（P＜0.01），并顯著高于正常組（P＜0.01）。結果提示，六味地黃丸可以使大鼠血管中HO-1基因高表達。各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達測定結果見表3，蛋白表達電泳圖見圖1。

表3 各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達測定結果（±s，n＝12）Tab 3 mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue of rats in each group（±s，n＝12）

表3 各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達測定結果（±s，n＝12）Tab 3 mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組HO-1蛋白1.25±0.24 1.32±0.27 3.82±0.62＊＊##4.01±0.71＊＊HO-1 mRNA 52.34±13.46 60.18±12.34 110.14±13.46＊＊##110.14±13.46＊＊

圖1 各組大鼠血管組織中HO-1蛋白表達電泳圖Fig 1 The protein expression electrophoregrums of HO-1 in vascular tissue of rats in each group

4 討論

高血糖可以引起血管內皮細胞的損傷，主要表現為血管內皮損傷和血管壁彈性等功能的改變，因此早期對血管內皮進行保護，是預防高糖引起血管功能改變繼而引起繼發性疾病的有效措施[4]。近幾年來關于HO-1與糖尿病及其并發癥的關系的研究備受關注，HO-1是細胞內源性保護蛋白，是血紅素代謝的關鍵酶和限速酶，其代謝產物有一氧化碳（CO）、膽綠素以及游離的2價鐵離子[5]，這些代謝產物都是重要的生物效應分子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[6]。HO-1/CO信號通路與血管內皮保護功能有著密切的關系，研究表明，HO-1能夠促進血管內皮細胞增殖[7]，減少血管內皮細胞凋亡[8]、修復內皮損傷[9]。用維生素E或丙丁酚進行治療的STZ大鼠腎小球上皮細胞、系膜細胞和毛血管內腔活性氧的含量變化與HO-1的變化相一致[10]，這提示HO-1能夠影響糖尿病引起的腎臟氧化損傷，因此促進體內HO-1的表達對內皮細胞損傷有保護作用。

六味地黃丸組方來至東漢張仲景所著的《金匱要略》，具有滋陰益腎的作用。現代醫學研究發現六味地黃丸具有降低血糖、血脂和抗氧化等作用[11]。在本實驗中筆者通過給予HO-1蛋白特異性抑制劑ZnPP（與HO-1蛋白特異性結合，只影響蛋白功能的發揮，不影響蛋白基因的表達）來考察六味地黃丸對血管調節作用與HO-1蛋白的關系：若給予ZnPP后能夠反轉六味地黃丸對糖尿病大鼠血管功能的作用，則說明六味地黃丸對糖尿病大鼠血管的調節作用與HO-1蛋白有關，反之則無關。本研究結果顯示，模型組大鼠血管功能紊亂，血管張力減弱；六味地黃丸組大鼠血管功能有所改善，并同時檢測到大鼠胸主動脈組織中HO-1 mRNA和蛋白表達量均升高；當給予HO-1蛋白抑制劑ZnPP后，雖反轉了六味地黃丸對糖尿病大鼠血管功能的改善作用，但胸主動脈組織中HO-1 mRNA和蛋白表達量同樣升高。以上結果提示，六味地黃丸對對糖尿病大鼠血管功能的改善作用與高表達血管組織中HO-1有一定相關性。

綜上，六味地黃丸對糖尿病大鼠血管損傷有一定的保護作用，其機制可能與高表達血管組織中HO-1有關。雖然單純提高血管組織中HO-1的表達還達不到對高糖致血管損傷的治療作用，但是在糖尿病早期和發展過程中給予六味地黃丸能夠起到延緩血管并發癥和輔助治療糖尿病的作用。

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Effects of Liuwei Dihuang Pills on HO-1 in Vascular Tissue of Diabetic Model Rats

LYU Xiaohui1，WANG Zhe2，SUN Jiayu1，CAI Zhigang1，ZHANG Ruipeng3，SHAN Aiyun1（1.Shenzhen Futian District TCM Hospital，Guangdong Shenzhen 518033，China；2.Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410013，China；3.Shenzhen Research Institute of Tsinghua University，Guangdong Shenzhen 518067，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Liuwei dihuang pills on heme oxygenase 1（HO-1）in vascular tissue of diabetic model rats.METHODS：Rats were randomly divided into normal group，model group，Liuwei dihuang pills group（14 g/kg，ig，s.i.d）and HO-1 inhibitor zinc protoporphyrin（ZPP，10 μmol/kg，ip，q.o.d）+Liuwei dihuang pills（14 g/kg，ig，s.i.d）group，with 12 rats in each group.Except for normal group，those groups were given streptozotocin intraperitoneally to induce diabetic model.After modeling，treatment groups were given relevant medicines，and normal group and model group were given normal saline intraperitoneally every 2 days for consecutive 4 weeks.The systolic blood pressure（SBP）of caudal artery and heart rate in rats were detected；the effects of Liuwei dihuang pills on the contraction response of thoracic aortic rings（TARs）irratated by phenylephrine（PE）were observed as well as the effects on the relaxation response of TARs irratated by acetylcholine（Ach）and sodium nitroprussiate（SNP）；mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue were examined.RESULTS：Compared with normal group，SBP of model group increased，and the relaxation response of TARs to Ach irritation decreased while the contraction response of TARs to PE irritation increased（P＜0.05）.There was no statistical significance in mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue（P＞0.05）.Compared with model group，the relaxation response of TARs to Ach irritation increased in Liuwei dihuang pills group，while the contruction response of TARs to PE irritation decreased；mRNA and protein expression of HO-1 increased in vascular tissue（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with Liuwei dihuang pills group，SBP of drug combination group increased continuously，while the relaxation response of TARs to Ach irritation decreased continously（P＜0.05）.There was no statistical significance in mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue（P＞0.05）.There was no statistical significance in heart rate among those groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Liuwei dihuang pills can improve vascular reactivity disorder of diabetic model rats，which is likely related to the expression up-regulation of HO-1 in vascular tissue.

Liuwei dihuang pills；Diabetes；Heme oxygenase 1；Vascular function；Rats

R966

A

1001-0408（2016）31-4379-03

2016-02-24

2016-05-05）

（編輯：林 靜）

深圳市科技研發基金（No.JCYJ2014041414500-7216）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：22181265@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥事管理。E-mail：253010652 @qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.18