云芝多糖對小鼠黑色素瘤B16細胞體外增殖和凋亡的影響及其機制Δ

魏士杰，陳文強（1.陜西理工大學校醫院，陜西漢中 723000；2.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000）

云芝多糖對小鼠黑色素瘤B16細胞體外增殖和凋亡的影響及其機制Δ

魏士杰1＊，陳文強2#（1.陜西理工大學校醫院，陜西漢中 723000；2.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000）

目的：研究云芝多糖（CVP）對小鼠黑色素瘤B16細胞體外增殖、凋亡的影響及其機制。方法：采用MTT法測定以二甲基亞砜（DMSO，陰性對照）和0（空白對照）、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/ml CVP分別培養細胞48、72 h后的細胞存活率，計算半數抑制濃度（IC50）；流式細胞術測定以DMSO（陰性對照）和0（空白對照）、0.5 μg/ml CVP分別培養細胞24、48、72 h后的細胞凋亡率；實時熒光定量聚合酶鏈式反應法測定以DMSO（陰性對照）、0.5 μg/ml CVP培養細胞48、72 h后細胞中凋亡相關基因P53、Bcl-2、Fas mRNA的表達。結果：0.156～10.0 μg/ml CVP對B16細胞的生長均有抑制作用，并在0.156～0.625 μg/ml范圍內呈濃度和時間依賴性，培養48、72 h的IC50分別為（0.32±0.01）、（0.18±0.04）μg/ml。0.5 μg/ml CVP培養細胞24、48、72 h后，細胞凋亡率較陰性對照和空白對照均明顯升高（P＜0.01）；0.5 μg/ml CVP培養細胞48、72 h后，細胞中P53、Bcl-2、Fas mRNA表達水平較陰性對照明顯降低（P＜0.01）。結論：CVP可抑制小鼠B16細胞的增殖并誘導其凋亡，其機制可能與下調細胞中P53、Bcl-2和Fas基因的表達有關。

云芝多糖；黑色素瘤B16細胞；增殖；凋亡；體外

云芝為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌[Coriolus versicolor（L. ex Fr.）Quel]的干燥子實體，是我國傳統的藥用真菌，被廣泛用于癌癥和免疫缺陷等疾病的治療[1]。云芝子實體或菌絲體提取液經注射或口服給藥后對胃癌、結腸癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等多種實體瘤的生長均有明顯抑制作用[2-3]。云芝多糖（Coriolus versicolor polysaccharides，CVP），在中國也稱云芝糖肽（Polysaccharide peptide，PSP），在日本多稱云芝多糖（Polysaccharide krestin，PSK），是從云芝子實體或培養的菌絲體中提取的具有多種藥理作用的多糖類物質[4]。CVP是云芝子實體中的主要活性成分，也是天然多糖的典型代表，具有直接抑制腫瘤細胞生長的作用[5]。真菌子實體和菌絲體代表了真菌的不同發育階段，兩者體內多糖的相對分子質量不同，結構也有差異[6]，推測其抗腫瘤的作用也有不同。目前報道的有關CVP的抗腫瘤研究也多以菌絲體多糖為研究對象[7]。在中國傳統中醫藥中，云芝子實體是多類中藥產品的原料，子實體多糖是中藥制劑或產品的主要成分之一，具有廣泛的免疫調節和抗腫瘤作用，子實體多糖有潛力開發成為抗腫瘤藥物，但目前尚未見其用于抗小鼠黑色素瘤B16細胞株研究的相關報道。鑒于此，本研究以野生云芝子實體為研究對象，通過提取并純化制得CVP，考察其對小鼠黑色素瘤B16細胞株增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機制，以期為CVP抗腫瘤機制的進一步研究和臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

0408-2型臺式低速離心機（上海醫療器械集團有限公司手術器械廠）；ABI 7500 Fast型實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀（美國應用生物系統公司）；FACS CaliburTM型流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）；MultiskanTM型全波長酶標儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 藥材與試劑

野生云芝子實體購自陜西省漢中市漢臺區藥材市場，由陜西省食藥用菌工程技術研究中心鄧百萬教授鑒定為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌[Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel]的干燥子實體。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國Sigma公司）；Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號：BC28KA1892）；動物組織/細胞RNA提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：40134）；寶生物染料法熒光定量試劑盒（上海皓嘉科技發展有限公司，批號：AK8006）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞株

小鼠黑色素瘤B16細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 CVP的提取與精制

準確稱取野生云芝粉末50.0 g，用95%乙醇在80℃條件下水浴40 min脫脂，收集藥渣，風干。脫脂后的云芝粉末加入適量蒸餾水，超聲30 min，抽濾，重復超聲提取1次，棄去藥渣，合并2次提取液。將提取液減壓濃縮至原體積的1/4后，用2倍體積95%乙醇邊攪動邊沉淀，即得粗多糖，計算出多糖得率（多糖沉淀干質量/云芝子實體干質量×100%）為7.74%。將粗多糖經過Sevage法去除蛋白及利用活性炭脫色后[8]得精制多糖，經苯酚-硫酸法[9]測定其葡聚糖含量為54.69%。

2.2 細胞培養

將小鼠黑色素瘤B16細胞培養在含10%熱滅活FBS和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中。待細胞生長至70%～80%融合時，吸棄細胞培養液，加入1～2 ml 0.25%胰酶溶液消化3～5 min，用新鮮培養液收集細胞懸液，然后轉移至離心管中，以1 000×g離心3 min，收集細胞沉淀，用新鮮RPMI 1640培養基重懸細胞。將細胞懸液與培養液按1∶4的比例混合后轉接至3個100 mm培養皿中，每皿加10 ml培養液，振蕩均勻后，將培養皿放入37℃、5%CO2孵箱中培養。

2.3 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞體外增殖的影響

采用MTT法測定細胞活性。將處于對數生長期的小鼠黑色素瘤B16細胞以1×104個細胞/孔的密度種植于含100μl培養液的96孔板中，培養24 h。棄去50μl培養液后再分別加入0（空白對照）、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml CVP和等體積的DMSO溶液（陰性對照），然后用培養液調整體積至100μl，每個質量濃度設置3個重復孔。培養48、72 h后于各孔細胞中分別加入30μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續培養4 h，吸棄各組細胞的培養液并加入100μl DMSO進行溶解，振蕩器上充分振勻后，在570 nm波長下用全波長酶標儀測定光密度（OD）值。細胞增殖抑制率（%）＝用藥組平均OD值/陰性對照組平均OD值×100%，細胞存活率（%）＝1－細胞增殖抑制率。以細胞存活率對CVP對數進行直線回歸和統計處理，并采用加權直線回歸法計算半數抑制濃度（IC50）。

2.4 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞體外凋亡的影響

采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。將處于對數生長期的小鼠黑色素瘤B16細胞按1×104個/孔的密度接種于含100μl培養液的96孔板中，分別加入0（空白對照）、0.5 μg/ml的CVP和等體積的DMSO溶液（陰性對照）培養細胞24、48、72 h后，70%乙醇4℃固定細胞24 h，然后加入0.1 mg/ml核糖核酸酶A（RNase A）37℃消化30 min，取出放入冰水中，用0.5 ml碘化丙啶（PI，50 μg/ml）4℃避光染色1 h，用流式細胞儀進行分析。PI標記的流式細胞技術分析時，在G1峰左側出現亞G1期（Sub-G1）峰或A峰（或稱凋亡峰），其峰值高低反映了細胞發生凋亡的比例。

2.5 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞中凋亡相關基因表達的影響

采用RT-PCR法分析凋亡相關基因的表達。按“2.4”項下方法培養細胞，48 h后收集細胞，提取細胞總RNA，采用TIANGEN快速反轉錄預混試劑（KR108）進行反轉錄，RTPCR使用寶生物染料法熒光定量試劑盒進行。以1 μg cDNA為模板擴增細胞凋亡相關基因P53（GenBank登錄號：NM_ 000546）、Bcl-2（GenBank登錄號：NM_000633）和Fas（Gen-Bank登錄號：NM_152876），以β-actin基因（GenBank登錄號：NM_001101）為內參。P53引物序列：上游為5′-GCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGC-3′，下游為5′-GGCCAACTTGTTCAGTGGAGCCCCGG-3′，產物大小為502 bp；Bcl-2引物序列：上游為5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTG-3′，下游為5′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTGTTT-3′，產物大小為349 bp；Fas引物序列：上游為5′-AGTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC-3′，下游為5′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGCT-3′，產物大小為343 bp；β-actin上游為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGC-3′，下游為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′，產物大小為540 bp。反應體系：SYBR premix EX TaqⅡ10 μl，上、下游引物各0.4 μl，染料0.4 μl，cDNA模板2 μl，加水至20 μl。擴增條件：95℃、90 s；94℃、10 s；60℃、30 s；40個循環?；虻南鄬Ρ磉_量使用2－ΔΔct分析[10]，以DMSO對照樣品中P53、Bcl-2和Fas基因的表達量標準化為100%，CVP處理樣品的相對表達量即可通過公式計算。每組數據重復測定3次，求出標準差。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖的抑制作用

CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞的增殖具有較強的抑制作用，在0.156～0.625μg/ml范圍內其抑制作用呈現明顯的濃度和時間依賴性。當CVP質量濃度大于0.625 μg/ml時，其對細胞的抑制作用進入平臺期。作用48、72 h的IC50分別為（0.32± 0.01）、（0.18±0.04）μg/ml。CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖的影響結果見圖1。

圖1 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖的影響結果Fig 1 Effects of CVP on the proliferation of murine melanoma B16 cell

3.2 CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡的抑制作用

與空白對照組和陰性對照組比較，0.5μg/ml CVP組細胞的凋亡率隨培養時間的延長而升高，作用48、72 h后細胞的凋亡率達到66.95%、75.40%，差異均有統計學意義（P＜0.01）。培養不同時間后各組細胞凋亡率測定結果見表1，流式細胞圖見圖2。

注：與空白對照組、陰性對照組比較，＊P＜0.01Note：vs.blank control group and negative control group，＊P＜0.01

圖2 培養不同時間后各組細胞凋亡的流式細胞圖Fig 2 Flow cytometry of cell apoptosis after cultured for different time

3.3 CVP對凋亡相關基因表達量的影響

培養48 h后，與陰性對照組比較，CVP組小鼠細胞中P53、Bcl-2和Fas mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；培養72 h后，CVP組小鼠黑色素瘤B16細胞中P53、Fas mRNA表達水平較培養48 h后繼續降低，Fas mRNA水平略有升高，但均顯著低于陰性對照組（P＜0.01）。細胞中凋亡相關基因P53、Bcl-2和Fas mRNA表達水平測定結果見圖3。

4 討論

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma）是一類起源于神經嵴的黑色素細胞、極易發生轉移的惡性腫瘤，由于其惡性程度高、預后差，近年來已成為發病率增長最快的惡性腫瘤之一[11-12]。因此尋找敏感性強、作用靶點多的有效藥物一直是腫瘤研究學者關注的熱點。有研究顯示，云芝菌絲體多糖具有較強的抑制小鼠黑色素瘤細胞B16的作用，且其對該細胞的抑制作用明顯高于其他腫瘤細胞[12]。因此，從云芝子實體中提取多糖用于臨床治療黑色素瘤B16的候選藥物具有重要的意義。本研究結果顯示，CVP作用于B16細胞48、72 h后的IC50分別為（0.32±0.01）、（0.18±0.04）μg/ml，該結果說明CVP對小鼠黑色素瘤B16細胞具有較強抑制活性。筆者據CVP的IC50值以及前人的研究結果[12-13]，選取0.5 μg/ml CVP進行細胞凋亡的檢測。結果顯示，在這一質量濃度下，作用48 h后凋亡細胞的比例為66.95%，72 h后為75.4%，與空白對照組和陰性對照組比較凋亡率顯著升高。

圖3 各組細胞中凋亡相關基因P53、Bcl-2和Fas mRNA表達測定結果注：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01Fig 3 The mRNA expression of P53，Bcl-2 and Fas of cells in each group（±s，n＝3）Note：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01

細胞凋亡的發生主要有2條信號通路介導，一條是通過線粒體的信號通路，另一條是通過Fas/FasL及TNF/TNFR死亡受體通路。目前研究認為腫瘤的發生、發展均與細胞凋亡相關[14]。在線粒體通路中，Bcl-2家族成員發揮著重要作用，是目前研究最多的一類細胞凋亡調控蛋白因子，屬于一種抗凋亡蛋白；P53是定位于線粒體上的轉錄因子，能與促凋亡蛋白Bak等直接作用，解除促凋亡蛋白Bak與抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用，進而改變線粒體的通透性，誘導細胞凋亡；Fas基因是凋亡信號基因，其基因產物Fas蛋白是一種細胞凋亡信號受體，屬于死亡受體通路。本實驗通過表達譜分析發現，CVP可以下調小鼠黑色素瘤B16細胞中Bcl-2和P53基因的表達，且隨著CVP作用時間的延長，其對P53基因的下調作用越明顯，而對Bcl-2基因的下調則達到了平衡，這說明CVP可通過調節Bcl-2和P53基因的表達來誘導小鼠黑色素瘤B16細胞株的凋亡。同時發現死亡受體中的Fas基因表達也被CVP下調，說明著2條通路都參與CVP所致的小鼠黑色素瘤B16細胞株的凋亡。

綜上所述，CVP能通過誘導細胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16細胞的生長，其作用機制可能與下調細胞中P53、Bcl-2和Fas基因的表達相關。

[1] 張俊，吳超.云芝多糖對機體細胞因子影響的研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2011，13（10）：263.

[2] Luo KW，Yue GG，Ko CH，et al.In vivo and in vitro anti-tumor and anti-metastasis effects of Coriolus versicolor aqueous extract on mouse mammary 4T1 carcinoma[J]. Phytomedicine，2014，21（8/9）：1 078.

[3] Fritz H，Kennedy DA，Ishii M，et al.Polysaccharide K and Coriolus versicolor extracts for lung cancer：a systematic review[J].Integr Cancer Ther，2015，14（3）：201.

[4] Sakagami H，Aoki T，Simpson A，et al.Induction of immunopotentiation activity by a protein-bound polysaccharide，PSK：review[J].Anticancer Res，1990，11（2）：993.

[5] Cui J，Chisti Y.Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor：physiological activity，uses，and production[J].Biotechnol Adv，2003，21（2）：109.

[6] 張勁松，韓煒瑋，潘迎捷.云芝子實體多糖（CVP）化學結構研究Ⅲ[J].菌物系統，2001，20（4）：531.

[7] Dong Y，Kwan CY，Chen ZN，et al.Antitumor effects of a refined polysaccharide peptide fraction isolated from Coriolus versicolor：in vitro and in vivo studies[J].Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1996，92（2）：140.

[8] 雷迎，陳寶，王茂茂，等.云芝多糖提取工藝的優化及其性能研究[J].食品科技，2011，36（11）：169.

[9] 李輝，羅佳波.苯酚-硫酸法測定的圍樂顆粒中總多糖的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：685.

[10] Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method[J].Methods，2001，25（4）：402.

[11] Pacheco I，Buzea C，Tron V.Towards new therapeutic approaches for malignant melanoma[J].Expert Rev Mol Med，2011，13（13）：461.

[12] Harhaji Lj，Mijatovi? S，Maksimovi?-Ivani? D，et al.Anti-tumor effect of Coriolus versicolor methanol extract against mouse B16 melanoma cells：in vitro and in vivo study[J].Food Chem Toxicol，2008，46（5）：1 825.

[13] Ho CY，Kim CF，Leung KN，et al.Differential anti-tumor activity of Coriolus versicolor（Yunzhi）extract through p53-and/or Bcl-2-dependent apoptotic pathway in human breast cancer cells[J].Cancer Biol Ther，2005，4（6）：638.

[14] Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis[J].Nature，2000，407（6 805）：770.

Effects of Coriolus versicolor Polysaccharides on Proliferation and Apoptosis of Murine Melanoma B16 Cell in vitro and Its Mechanism of Action

WEI Shijie1，CHEN Wenqiang2（1.Center Hospital Affiliated to Shaanxi Sci-Tech University，Shaanxi Hanzhong 723000，China；2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi Sci-Tech University，Shaanxi Hanzhong 723000，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Coriolus versicolor polysaccharides（CVP）on in vitro proliferation and apoptosis of murine melanoma B16 cell and its mechanism.METHODS：MTT assay was used to determine the survival rate of murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0（blank control），0.156，0.312 5，0.625，1.25，2.5，5.0 and 10.0 μg/ml CVP for 48，72 h，and the IC50was calculated.Flow cytometry was used to determine the apoptotic rate of murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0（blank control），0.5 μg/ml CVP for 24，48，72 h.Quantitation Real-time PCR（qRT-PCR）was used to determine the mRNA expression of cell apoptosis-related gene P53，Bcl-2 and Fas in murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0.5 μg/ml CVP for 48，72 h.RESULTS：0.156-10.0 μg/ml CVP could inhibit the growth of B16 cells，in concentration and time-dependent manner within 0.156-0.625 μg/ml；IC50of B16 cells after cultured for 48 and 72 h were（0.32±0.01），（0.18±0.04）μg/ml.After cultured with 0.5 μg/ml CVP for 24，48，72 h，apoptotic rates of B16 cells were increased significantly，compared to negative control and blank control（P＜0.01）.After cultured with 0.5 μg/ml CVP for 48，72 h，mRNA expression of P53，Bcl-2 and Fas were decreased significantly，compared to negative control（P＜0.01）.CONCLUSIONS：CVP can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of B16 cells，the mechanism of which may be associated with the expression down-regulation of P53，Bcl-2 and Fas gene.

Coriolus versicolor polysaccharides；Murine melanoma B16 cell；Proliferation；Apoptosis；in vitro

R95

A

1001-0408（2016）31-4363-04

2016-01-04

2016-07-22）
（編輯：林 靜）

陜西省“13115”科技創新工程計劃項目（No.2008 ZDGC-04）

＊主治醫師。研究方向：藥用真菌對腫瘤細胞的影響。E-mail：448347936@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：藥用真菌資源的開發和利用。電話：0916-2642832。E-mail：wenqiangc@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.13