救必應酸琥珀酰酯在大鼠體內的藥動學和絕對生物利用度研究Δ

赫玉芳，南敏倫，趙昱瑋，呂 娜，李 闊，王文君，何忠梅（.吉林省中醫藥科學院植物化學研究所，長春 002；2.吉林修正藥業新藥開發有限公司，長春 08；.吉林農業大學中藥材學院，長春 08；.長春市綠園區西新雙豐社區衛生服務站，長春 00）

救必應酸琥珀酰酯在大鼠體內的藥動學和絕對生物利用度研究Δ

赫玉芳1，2＊，南敏倫1，趙昱瑋1，呂 娜3，李 闊3，王文君4，何忠梅3（1.吉林省中醫藥科學院植物化學研究所，長春 130012；2.吉林修正藥業新藥開發有限公司，長春 130118；3.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；4.長春市綠園區西新雙豐社區衛生服務站，長春 130013）

目的：研究救必應酸琥珀酰酯（SRA）在大鼠體內的藥動學和絕對生物利用度。方法：將Wistar大鼠隨機分成ig組（30 mg/kg）和尾iv組（15 mg/kg），每組10只，按相應給藥方法和劑量給予SRA，于給藥后5、10、20、30、40、60、90、150、210、270、390、510 min尾靜脈取血0.2 ml。以丹參酮ⅡA為內標，采用反相-高效液相色譜法測定其血藥濃度，3p97軟件計算藥動學參數和絕對生物利用度。結果：ig組大鼠的cmax為（1.02±0.27）μg/ml，tmax為（26.64±2.74）min，t1/2為（42.79±3.46）min，AUC0-510min為（92.27± 9.26）μg·min/ml；尾iv組大鼠的t1/2為（17.21±1.58）min，AUC0-510min為（320.50±11.89）μg·min/ml。SRA口服絕對生物利用度為14.40%。結論：SRA在大鼠體內的藥動學特征符合單室模型；口服絕對生物利用度較高。

救必應酸琥珀酰酯；反相-高效液相色譜法；大鼠；藥動學；絕對生物利用度

救必應酸（Rotundic acid）也稱鐵冬青酸，是一種五環三萜酸類化合物。據文獻報道，救必應酸具有抗腫瘤[1-3]、降血脂[4]、預防和治療心腦血管疾病[5]等藥理作用。但由于救必應酸極性較小、脂溶性較強、水溶性較差、生物利用度較低，嚴重制約了其在臨床上的應用。

近年來從天然中草藥入手，采用中藥化學的提取分離技術找到先導化合物，然后經過化學修飾得到結構明確、溶解性更好、生物利用度更高、生物活性更強、療效更確切的化合物是目前新藥研發的趨勢和熱點。國內外學者已經開展了對五環三萜類化合物的結構修飾工作，如齊敦果酸、熊果酸、甘草次酸、樺木酸、積雪草酸、乳香酸等，并進行抗腫瘤活性研究[6-10]，而且已篩選出一些高溶解度、高活性、低毒性的化合物?；谝陨显颍P者為進一步增加救必應酸的極性、提高其水溶性、改善其生物利用度，也進行了救必應酸的結構修飾，首次成功合成了新化合物救必應酸琥珀酰酯（Succinyl rotundic acid，SRA）。本實驗中，筆者采用反相-高效液相色譜（RP-HPLC）法測定了不同給藥途徑下大鼠血漿中SRA的濃度，從而研究SRA的藥動學過程，計算SRA的絕對生物利用度。SRA和救必應酸的結構式見圖1。

圖1 SRA和救必應酸的結構式Fig 1 Molecular structures of SRAand rotundic acid

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型HPLC儀，包括G1311C高壓輸液泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B紫外檢測器、M8301AA色譜工作站（美國安捷倫公司）；5810R型臺式高速離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；BSA224S型分析天平（德國賽多利斯公司）；HHS-21-6型水浴恒溫振蕩器（常州諾基儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

SRA（吉林省中醫藥科學院植物化學研究所自制，批號：2050801，純度：≥99%）；丹參酮ⅡA（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：110766-200619，純度：≥98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，體質量180～220 g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（吉）-2014-0004。本實驗已通過吉林省實驗動物倫理委員會同意。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05%磷酸水（83∶17），流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μl。

2.2 SRA溶液的制備

精密稱取SRA5 mg，置于5 ml量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得到1 mg/ml溶液，置于4℃冰箱中保存備用。臨用前再制備成所需質量濃度的溶液。

2.3 給藥溶液的制備

1．2．3 結構式家庭治療具體方法 第一次治療：治療師與家庭成員建立良好的關系，進入家庭，了解家庭成員之間的互動模式。將患兒的個人問題帶入家庭，讓家庭充分意識到兒童個人的病癥，與家庭氛圍缺陷的關系，是整個家庭失功能部分的外在表現。如夫妻吵架不能產生良好的互動模式，為避免家庭沖突，兒童介入來填補家庭中失功能部分，以維持目前的家庭模式平衡。

ig給藥溶液：SRA用5%的二甲基亞砜（DMSO）-植物油溶解制成3.0 mg/ml混懸液，臨用前制備。iv給藥溶液：SRA用10%DMSO-生理鹽水溶解制成15 mg/ml澄清液，臨用前制備。

2.4 給藥方案

將20只Wistar大鼠隨機分成ig組（30 mg/kg）和尾iv組（15 mg/kg），每組10只。大鼠實驗前適應性喂養7 d，給藥前禁食12 h、不禁水，按相應給藥方法和劑量給予相應藥物，給藥后2 h內禁水、全程禁食。分別于給藥后5、10、20、30、40、60、90、150、210、270、390、510 min尾靜脈取血0.2 ml（給藥后2 h內，每0.5 h ip與取血量等同的生理鹽水，2 h后允許自由飲水），分離血漿，將血漿密封后置于－20℃冰箱保存，備用[11]。

2.5 血漿樣品的處理

取血漿0.2 ml加5.0 μg/ml丹參酮ⅡA（內標）甲醇溶液0.2 ml，旋渦振蕩30 s，靜置10 min后將此混合液以離心半徑為13 cm、6 000 r/min離心10 min，除去蛋白，取上清液，加入到含有25 mg氯化鈉的4 ml離心管中，渦旋混合10 min，以離心半徑為13 cm、6 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，取20 μl進樣分析[12]。

2.6 分析方法學評價

2.6.1 方法專屬性 取空白血漿，以及大鼠ig給藥后30、90 min的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理后，照“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜。結果顯示，SRA與內標能完全分離，血漿中內源性物質不干擾SRA和內標的檢測，SRA的保留時間約為6.25 min，內標的保留時間約為7.26 min。血漿中SRA及內標的理論板數均大于4 000。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.6.3 精密度試驗 取SRA溶液及大鼠空白血漿，按倍數稀釋法制成低、中、高3種質量濃度（0.50、10.00、20.00 μg/ml）的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理后，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。同日內測定6次考察日內精密度，連續測定6 d考察日間精密度。結果顯示，低、中、高質量濃度血漿樣品SRA峰面積的日內RSD分別為2.98%、1.95%、1.35%（n＝6），日間RSD分別為3.02%、2.25%、1.89%（n＝6）。結果表明方法精密度良好。

2.6.4 回收率試驗 （1）方法回收率：制備低、中、高質量濃度（0.50、10.00、20.00 μg/ml）的SRA血漿樣品，每個質量濃度6份，按“2.5”項下方法處理后，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，依據回歸方程計算SRA的濃度，計算方法回收率。結果顯示，低、中、高質量濃度血漿樣品的方法回收率分別為（98.21±9.02）%、（97.26±6.58）%、（98.77±2.44）%，RSD分別為3.08%、2.65%、1.89%（n＝6）。（2）提取回收率：制備低、中、高質量濃度（0.50、10.00、20.00 μg/ml）的SRA對照品溶液，每個質量濃度6份，直接進樣測定峰面積為A1；另取SRA對照品溶液適量，用空白血漿制成質量濃度分別為5.00、100.00、200.00 μg/ml的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理后，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積為A2。以A2/A1×100%計算提取回收率，結果顯示，低、中、高質量濃度血漿樣品提取回收率分別為（72.35±4.15）%、（71.98±2.23）%、（73.03±1.02）%，RSD分別為3.32%、2.69%、3.02%（n＝6）。

2.6.5 穩定性考察 取SRA溶液及大鼠空白血漿，按倍數稀釋法制成低、中、高質量濃度（0.50、10.00、20.00 μg/ml）的血漿樣品，分別考察在室溫下放置6 h、－20℃放置14 d、反復凍融3次后的穩定性。結果顯示，3種條件下血漿樣品中SRA峰面積的RSD均小于3%，說明血漿樣品在上述條件下穩定[13]。

2.7 藥動學參數和絕對生物利用度

取“2.4”項下各時間點的血漿，按“2.5”項下方法處理后，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，依據回歸方程計算SRA的質量濃度，繪制藥-時曲線。采用3p97藥動學軟件，按單室模型計算藥動學參數，并計算絕對生物利用度（F，%）＝（AUCig×D尾iv）/（AUC尾iv×Dig）×100%，式中D為給藥劑量[12]。結果顯示，大鼠體內SRA的口服絕對生物利用度為14.40%。兩組大鼠血漿中SRA的藥-時曲線見圖3，藥動學參數見表1。

圖3 兩組大鼠血漿中SRA的藥-時曲線Fig 3 Plasma concentration-time curves of SRA of rats in two groups

表1 兩組大鼠血漿中SRA的藥動學參數（±s，n＝10）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of SRA of rats in two groups（±s，n＝10）

表1 兩組大鼠血漿中SRA的藥動學參數（±s，n＝10）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of SRA of rats in two groups（±s，n＝10）

參數cmax，μg/ml tmax，min t1/2，min V，L/kg CL，ml/min AUC0-510min，μg·min/ml ig組1.02±0.27 26.64±2.74 42.79±3.46 18.54±1.25 1.18±0.37 92.27±9.26尾iv組17.21±1.58 0.92±0.18 0.10±0.08 320.50±11.89

3 討論

SRA是在救必應酸結構修飾中發現的具有生物活性的新化合物。為研究其生物利用度，本實驗建立了RP-HPLC法用于測定大鼠體內SRA血藥濃度，并對ig和iv給藥途徑下的藥動學參數進行了檢測分析。實驗結果可為SRA在不同給藥途徑下的藥效學研究提供給藥劑量的參考。

本實驗結果表明，大鼠體內SRA的口服絕對生物利用度為14.40%，筆者以前的研究結果顯示救必應酸的生物利用度僅為4.52%[14]。經過實驗發現，救必應酸具有較強的親脂性，為了提高其生物利用度，可以在救必應酸的結構中接一些親水性的基團，以增加救必應酸的親水性。因此，經過結構修飾后得到的化合物SRA與其先導化合物救必應酸相比，生物利用度有了較大提高，成藥性更強。實驗所建立的SRA的血藥濃度測定方法經過方法學研究，證明了其能很好地分離SRA及內標，并且不受輔料的干擾，方法靈敏度高、專屬性強，能夠滿足血藥濃度和藥動學研究的需要。本實驗結果為救必應酸進一步的結構修飾提供了參考和借鑒。

[1] 許睿.救必應化學成分研究及抗腫瘤活性成分初步篩選[D].廣州：廣東中醫藥大學，2009.

[2] He YF，Nan ML，Sun JM，et al.Synthesis，characterization and cytotoxicity of new rotundic acid derivatives[J]. Molecules，2012，17（2）：1 278.

[3] He YF，Nan ML，Sun JM，et al.Design，synthesis and cytotoxicity of cell death mechanism of rotundic acid derivatives[J].Bioorg Med Chem Lett，2013，23（9）：2 543.

[4] Chen Y，He YF，Nan ML，et al.Novel rotundic acid derivatives：synthesis，structural characterization and in vitro antitumor activity[J].Int J Mol Med，2013，31（2）：353.

[5] 趙全成，南敏倫，赫玉芳，等.救必應酸在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應用：中國，201010204596.9[P].2010-06-22.

[6] 賀興隆.齊墩果酸衍生物的合成與表征及其抑菌活性的研究[D].大連：遼寧師范大學，2011.

[7] Meng YQ，Liu D，Cai LL，et al.The synthesis of ursolic acid derivatives with cytotoxic activity and the investigation of their preliminary mechanism of action[J].Bioorg Med Chem，2009，17（2）：848.

[8] 楊定菊，李穎，尹述凡.3-O-乙?；芄?3-乙酰基-2-[（未）取代苯基]-2，3-二氫-1，3，4-噁二唑-5-甲酯的合成及其抗炎活性研究[J].有機化學，2008，28（6）：1 055.

[9] Liu D，Meng YQ，Zhao Y.Synthesis and anti-tumor activity of novel amide derivativies of ursolic acid[J].Chem Res Chinese U，2008，24（1）：42.

[10] Yamaguchi H，Noshita T，Yu T，et al.Novel effects of glycyrrhetinic acid on the central nervous system tumorigenic progenitor cells：induction of actin disruption and tumor cell-selective toxicity[J].Eur J Med Chem，2010，45（7）：2 943.

[11] 韓文莉，陸巍，何東平，等.鹽酸小檗堿磷脂復合物在兔體內的藥動學及相對生物利用度研究[J].中國藥房，2011，22（17）：1 564.

[12] 孫亞楠，張祥，劉子榮，等.益母草堿口服油包油微乳在大鼠體內的藥動學研究[J].中國藥房，2015，26（1）：30.

[13] 張紅艷，孫洪勝，劉健，等.葛根素固體自微乳膠囊在大鼠體內的藥動學研究[J].中國藥房，2015，26（34）：4 773.

[14] 赫玉芳.救必應酸的制備及其衍生物的設計、合成和抗腫瘤活性研究[D].長春：吉林大學，2013.

Pharmacokinetics and Absolute Bioavailability Study of Succinyl Rotundic Acid in Rats

HE Yufang1，2，NAN Minlun1，ZHAO Yuwei1，LYU Na3，LI Kuo3，WANG Wenjun4，HE Zhongmei3（1.Institute of Phytochemistry Research，Jilin Academy of Chinese Medical Sciences，Changchun 130012，China；2.Jilin Xiuzheng Pharmaceutical Development Co.，Ltd.，Changchun 130118，China；3.College of Chinese Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；4.Changchun Lüyuan District Xixin Shuangfeng Community Health Service Station，Changchun 130013，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics and absolute bioavailability of succinyl rotundic acid（SRA）in rats. METHODS：Wistar rats were randomly divided into intragastric injection（ig）group（30 mg/kg）and tail intravenous injection（iv）group（15 mg/kg），with 10 rats in each group.They were given SRA with relevant usage and dosage.The blood sample of tail vein 0.2 ml was respectively taken after 5，10，20，30，40，60，90，150，210，270，390，510 min of administration.The plasma concentration of SRA was determined by RP-HPLC using tanshinoneⅡAas internal standard.The pharmacokinetic parameters and absolute bioavailability were calculated by using 3p97 software.RESULTS：The pharmacokinetic parameters of ig group were that cmaxwas（1.02±0.27）μg/ml，tmaxwas（26.64±2.74）min，t1/2was（42.79±3.46）min and AUC0-510minwas（92.27±9.26）μg·min/ml；those of tail iv group were that t1/2was（17.21±1.58）min，and AUC0-510minwas（320.50±11.89）μg·min/ml.Oral obsolute bioavailability of SRA was 14.40%.CONCLUSIONS：The pharmacokinetic characteristics of SRA in rats conform to one-compartment model，and the absolute bioavailability is high.

Succinyl rotundic acid；RP-HPLC；Rats；Pharmacokinetics；Absolute bioavailability

R969.1

A

1001-0408（2016）31-4350-03

2016-01-19

2016-03-23）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學基金資助項目（No.31470418）

＊研究員，博士。研究方向：植物化學及結構修飾。電話：0431-86058683。E-mail：hyf_1992@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.09