黃芪藥渣中阿拉伯木聚糖（AX?Ⅰ?1）的提取純化、結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化作用

劉　磊，李　科，郝　霞，王桂臻，秦雪梅，杜冠華，張　翔

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，2.中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原030006；3.中藥功效物質(zhì)與新藥創(chuàng)制山西省重點實驗室，太原030006；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050；5.美國路易斯維爾大學(xué)，路易斯維爾40201）

黃芪藥渣中阿拉伯木聚糖（AX?Ⅰ?1）的提取純化、結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化作用

劉磊1，2，3，李科2，3，郝霞1，2，3，王桂臻1，2，3，秦雪梅2，3，杜冠華4，張翔5

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，2.中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原030006；3.中藥功效物質(zhì)與新藥創(chuàng)制山西省重點實驗室，太原030006；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050；5.美國路易斯維爾大學(xué)，路易斯維爾40201）

黃芪藥渣經(jīng)分級提取，再通過二乙氨乙基（DEAE）?纖維素52陰離子交換柱層析和Sephacryl S?400 HR凝膠柱層析分離純化，得到4個多糖組分AX?Ⅰ?1～AX?Ⅰ?4.對多糖AX?Ⅰ?1的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AX?Ⅰ?1含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖（摩爾比為0.006∶14.113∶8.284∶0.116∶0.468∶1），主鏈由阿拉伯糖和木糖通過β?（1→2），（1→3）和（1→4）苷鍵組成，支鏈由（1→4）βArap，（1→3）βGalp和（1→2）βMan組成，非還原末端由αRhap，βGclp和βGalp組成.對多糖AX?Ⅰ?1～AX?Ⅰ?4的抗氧化研究結(jié)果表明，這4個組分對羥基自由基、超氧陰離子自由基和1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）自由基均有一定的清除作用；當(dāng)濃度為0.1 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?2～AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率是陽性對照維生素C（Vc）的2倍.

黃芪藥渣；阿拉伯木聚糖；分離純化；結(jié)構(gòu)分析；抗氧化

黃芪是我國重要的大宗藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］.目前，黃芪在臨床上被廣泛應(yīng)用，素有“十方八芪”之說.據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)黃芪年消耗量超過100萬噸，而且逐年攀升，所以產(chǎn)生了大量的黃芪藥渣.目前的中藥藥渣處理方法雖然相對于早期有很大的變化，也開展了進(jìn)一步利用，如用于食用菌栽培基料、制成有機(jī)肥料、畜禽飼料及造紙等，但是這些產(chǎn)品附加值較低，甚至?xí)斐森h(huán)境的二次污染［2］.因此，開發(fā)中藥藥渣高附加值產(chǎn)品，構(gòu)建科學(xué)循環(huán)利用模式，建立循環(huán)產(chǎn)業(yè)鏈，對實現(xiàn)生態(tài)資源的良性循環(huán)具有深遠(yuǎn)意義.

中藥藥渣部分多為植物細(xì)胞壁成分，研究［3］已證實多種活性多糖蘊含在植物細(xì)胞壁組分（果膠、半纖維素）中.其中，半纖維素含有活性多糖的種類最豐富，被稱為潛在的“藥物資源庫”［4］.目前，已有對植物細(xì)胞壁中半纖維素進(jìn)行結(jié)構(gòu)及活性研究的相關(guān)報道.如周素梅等［5，6］對麥麩中阿拉伯木聚糖的結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有較強的抗腫瘤活性，可同時提高機(jī)體特異和非特異性免疫系統(tǒng)的反應(yīng).然而，該聚糖含量僅為谷物種皮的1％～2％，含量低，提取難度大.

我們［7］在前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪藥渣細(xì)胞壁半纖維素多糖的主要成分是阿拉伯糖和木糖，推測可能為阿拉伯木聚糖，并通過提取和分離純化，對其理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究.該組分含量約占黃芪細(xì)胞壁組分的10％，較麥麩中的阿拉伯木聚糖高約1000倍，但其結(jié)構(gòu)特點并不清楚.基于此，本文針對其中一種阿拉伯木聚糖AX?Ⅰ?1，研究了其單糖組成、連接位點、NMR譜學(xué)特征及體外抗氧化活性，以期為黃芪藥渣中阿拉伯木聚糖的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

黃芪藥材為山西渾源出產(chǎn)的半野生蒙古黃芪，經(jīng)山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定為豆科植物黃芪屬蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］.標(biāo)本保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心.

二乙氨乙基（DEAE）?纖維素?52及Sephacryl S?400 HR購自北京索萊寶科技有限公司；無水二甲基亞砜（純度99.7％，帶分子篩），購自百靈威化學(xué)試劑公司；氘代硼氫化鈉（NaBD4）購自上海江萊生物公司；1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH，純度95％）購自Alfa Aesar公司；氘代二甲基亞砜購自Cam?bridge Isotope Laboratories公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品購自中國計量科學(xué)研究院；糖醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司；其它試劑均為分析純.

Thermo Finnigan氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國熱電公司）；Bruker Tensor 27型紅外光譜儀和Bruker DRX 600 MHz核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；普析TU?1810型紫外?可見分光光度計（中國北京普析通用儀器有限公司）；依利特P230型高效液相色譜儀（中國大連依利特分析儀器有限公司）；Shodex RI?201H型示差折光檢測器（日本昭和電工科學(xué)儀器有限公司）.

1.2 黃芪藥渣阿拉伯木聚糖（AXs）的提取

1.2.1 黃芪藥渣的制備 將半野生蒙古黃芪粉碎，過100目篩；稱取粉末20 g，加入600 mL蒸餾水，于42℃水浴加熱1 h；離心，棄去上層清液，重復(fù)3次；收集沉淀烘干即得黃芪藥渣.

1.2.2 醇不溶性殘渣（A.I.R）粉末的制備 參照文獻(xiàn)［8］方法，取黃芪藥渣20 g，加入600 mL乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)80％），于60℃水浴加熱1 h，離心，棄去上層清液，重復(fù)多次，至上層清液無色；向沉淀中加入丙酮溶液（料液質(zhì)量比1∶10），靜置，棄去上層清液，沉淀烘干；在烘干后的粉末中加豬胰腺（料液質(zhì)量比1∶100，50 mmol／L Tris?HCl，pH＝7.0），置于搖床上孵育12 h（37℃，200 r／min），離心，棄去上層清液；用水清洗沉淀后，加入丙酮溶液（料液質(zhì)量比1∶10），靜置，棄去上層清液，沉淀烘干，得A.I.R粉末.

1.2.3 AXs的提取 參照文獻(xiàn)［9］方法，稱取A.I.R粉末20 g，加入400 mL 0.6％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）亞氯酸鈉溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH＝4.2～4.7，封口，置于75℃水浴中；每隔20 min手動搖動1次；1 h后繼續(xù)加入0.6％亞氯酸鈉溶液，并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH＝4.2～4.7；重復(fù)上述水解過程1 h.反應(yīng)完成后，使體系溫度迅速降低.離心、棄去上層清液后，用蒸餾水沖洗沉淀至中性，烘干得黃芪綜纖維素.

［10］方法，稱取黃芪綜纖維素10 g，加入500 mL果膠酶［3 U／（mmol·L－1），乙酸鈉50 mmol／L，pH＝5.0］，置于搖床上孵育24 h（24℃，200 r／min），離心，棄去上層清液，重復(fù)3次，用500 mL水清洗沉淀3次.向沉淀中加500 mL Na2CO3（50 mmol／L）和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（5 mmol／L）的混合溶液，搖床孵育24 h（24℃，200 r／min），離心，棄去上層清液，重復(fù)3次，用500 mL水清洗沉淀3次.

向上述所得沉淀中加500 mL KOH（1 mol／L）和NaBH4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％）的混合溶液，置于搖床上孵育12 h（24℃，200 r／min），離心，收集上層清液，重復(fù)3次，用500 mL水清洗沉淀3次，并將上層清液合并后于4℃保存，得黃芪半纖維素組分Ⅰ.

向上述半纖維素組分溶液中滴加冰醋酸至pH＝5.0，透析，濃縮凍干，得半纖維素組分Ⅰ的多糖，標(biāo)記為AX?Ⅰ.

1.3 Sevage法除蛋白及粗多糖分離純化

利用Sevage法［11］對AX?Ⅰ進(jìn)行脫蛋白處理.

［12］方法，將除蛋白后的AX?Ⅰ用DEAE?纖維素?52色譜柱和Sephacryl S?400 HR凝膠柱分離純化，得純化組分AX?Ⅰ?1，并用高效凝膠滲透色譜檢驗該多糖的純度.

1.4 AX?Ⅰ?1的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

1.4.1 高效凝膠滲透色譜法測定相對分子量 取標(biāo)準(zhǔn)品Dextran 4320，Dextran 12600，Dextran 73800，Dextran 110000，Dextran 289000和Dextran 496000，配制成2 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于高效凝膠色譜分析，每針進(jìn)樣20 μL，流動相為娃哈哈純凈水，流速為0.3 mL／min，柱溫35℃，凝膠柱為TSKgel G4000PWxl（10）（7.8 mm×300 mm），示差折光檢測器溫度34℃，測定各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間.以保留時間（tR）為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

將多糖AX?Ⅰ?1配制成濃度為2 mg／mL的樣品溶液.將測得的保留時間帶入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計算其分子量.

1.4.2 紅外光譜分析 采用KBr壓片法［13］測定樣品的紅外光譜（IR），掃描范圍為4000～400 cm－1.

1.4.3 GC?MS法測定單糖組成 參照文獻(xiàn)［14］方法，稱取5 mg多糖AX?Ⅰ?1，加入1.5 mL三氟乙酸（2 mol／L），密封后于110℃油浴水解3 h，空氣吹干后加入1 mL甲醇，重復(fù)3次，得到水解產(chǎn)物，溶于內(nèi)標(biāo)核糖醇溶液（0.1 mg／mL）中.加入NaHB4的DMSO溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％），置于搖床上孵育90 min（40℃，200 r／min），用冰乙酸調(diào)pH至中性.加入500 μL醋酸酐和50 μL 1?甲基咪唑，反應(yīng)10 min.加入5 mL蒸餾水終止反應(yīng)，用二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相，吹干后，復(fù)溶于二氯甲烷中，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，取2 μL濾液注入GC?MS.

氣相色譜條件：DB?5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.5 cm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL／min；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度220℃.程序升溫：起始溫度100℃，以5℃／min升至180℃，保持1 min；以1℃／min升至190℃，保持2 min；以30℃／min升至220℃，保持2 min；以1℃／min升至230℃，保持2 min；以20℃／min升至280℃，保持10 min.

質(zhì)譜條件：Xcalibur 2.0.7工作站，電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度220℃，傳輸線溫度250℃，掃描模式Full Scan，掃描范圍m／z 45～550.

1.4.4 甲基化分析 參照文獻(xiàn)［15］方法，稱取5 mg樣品，加入3 mL無水二甲基亞砜，充入氬氣，超聲至樣品溶解.稱取NaH粉末50 mg，加入5 mL無水二甲基亞砜，充入氬氣，磁力攪拌下于60℃反應(yīng)至不再產(chǎn)生氫氣為止.

將上述2種溶液合并，在氬氣保護(hù)下超聲1 h，冰浴冷卻，避光加入1 mL CH3I，在氬氣保護(hù)下，超聲30 min，溫度約為20℃，重復(fù)3次.加入5 mL Na2S2O3水溶液（4 mmol／L），再向反應(yīng)液中加入5 mL CHCl3萃取，吸出下層，重復(fù)5次；合并下層溶液，加5 mL蒸餾水，萃取，棄去上層清液，重復(fù)5次.向氯仿相中加入無水Na2SO4，過濾，氮氣吹干.用紅外光譜檢測3400 cm－1處無吸收峰，即為甲基化完全.加入2 mL三氟乙酸（2 mol／L），密封后于120℃水解90 min，空氣吹干后加入甲醇，重復(fù)3次，得到水解產(chǎn)物.加入2 mL新配制的NaBD4水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％），置于搖床上孵育90 min（40℃，200 r／min），加冰乙酸調(diào)節(jié)pH至中性，吹干.加入500 μL醋酸酐和50 μL 1?甲基咪唑，反應(yīng)10 min.加蒸餾水終止反應(yīng)，用二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相，吹干后，復(fù)溶于二氯甲烷中，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，取2 μL注入GC?MS.

1.4.5 核磁共振分析 參照文獻(xiàn)［16］方法，取干燥樣品30 mg溶解在0.5 mL DMSO?d6中，于30℃測定1H NMR，13C NMR和2D NMR（HMBC和HMQC）譜.

1.5 黃芪藥渣多糖AX?Ⅰ各組分的體外抗氧化作用

1.5.1 多糖AX?Ⅰ各組分對羥基自由基的清除作用 利用Fenton試劑［17］評價了黃芪藥渣多糖AX?Ⅰ各組分對羥基自由基的清除作用.將多糖配成0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg／mL的溶液.將1.0 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol／L）、1.0 mL水楊酸?乙醇溶液（9 mmol／L）和1.0 mL多糖待測液混合均勻，加入1.0 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol／L）啟動反應(yīng)，于37℃反應(yīng)30 min，在510 nm波長下測定溶液的吸光度.陽性對照組為維生素C（Vc），空白對照組為蒸餾水.按下式計算清除率（Scavenging effect）：

式中：A0為空白對照組的吸光度；Ai為多糖待測液組、陽性對照組的吸光度；Aj為1.0 mL水楊酸?乙醇溶液代替1.0 mL硫酸亞鐵溶液作試劑空白的吸光度.

1.5.2 多糖AX?Ⅰ各組分對超氧陰離子的清除作用 采用鄰苯三酚法測定了黃芪藥渣多糖對O2－·自由基的清除作用［18］.將多糖配成0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg／mL的溶液.將5.0 mL Tris?HCl緩沖溶液（50 mmol／L，pH＝8.2）和0.5 mL多糖溶液混合均勻，于37℃水浴預(yù)熱10 min，加入1.0 mL鄰苯三酚溶液（3.5 mmol／L），反應(yīng)6 min后，迅速加入0.5 mL HCl（8 mmol／L）終止反應(yīng)，于420 nm處測定吸光度.陽性對照組為Vc，空白對照組為蒸餾水.按下式計算清除率：

式中：A0為空白對照組吸光度；Ai為多糖待測液組、陽性對照組吸光度.

1.5.3 多糖AX?Ⅰ各組分對DPPH的清除作用 采用DPPH評價體系［19］研究了黃芪藥渣多糖對DPPH自由基的清除作用.分別將各2.0 mL多糖溶液（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg／mL）和2.0 mL DPPH溶液（0.16 mmol／L）混合均勻，于25℃反應(yīng)15 min，在517 nm處測定吸光度.陽性對照組為Vc，空白對照組為蒸餾水.按式（1）計算清除率，式中Aj為95％乙醇代替DPPH溶液作試劑空白的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2．1 黃芪藥渣阿拉伯木聚糖的分離與純化

根據(jù)硫酸?苯酚檢測結(jié)果，從洗脫曲線（圖1）可知，AX?Ⅰ經(jīng)DEAE?纖維素52分離得到水洗脫組分AX?Ⅰ?1，NaCl（0.3 mol／L）洗脫組分AX?Ⅰ?2，NaOH（0.1 mol／L）洗脫組分AX?Ⅰ?3和NaOH（0.3 mol／L）洗脫組分AX?Ⅰ?4.

Fig．1 Anion?exchange chromatography of AX?Ⅰon DEAE?cellulose?52

從AX?Ⅰ中共分離得到4種組分，經(jīng)真空冷凍干燥后均為白色粉末狀的多糖.采用Sephacryl S?400 HR凝膠柱對多糖AX?Ⅰ?1進(jìn)行純化，經(jīng)TSKgel G4000PWxl（10）凝膠滲透色譜柱測定，AX?Ⅰ?1的重均相對分子量為350000，且為單一對稱峰，純度較高.

2.2 AX?Ⅰ?1的紅外光譜分析

在多糖AX?Ⅰ?1的紅外光譜中，3407 cm－1處的強吸收峰為O—H的伸縮振動［20］，2930和1426 cm－1處的吸收峰為C—H的伸縮振動和變角振動［21］；1119和1045 cm－1處的吸收峰為吡喃糖環(huán)C—O—C的特征骨架振動［22］；892 cm－1處的吸收峰為β型吡喃糖的特征吸收［23］.由此可以初步判斷，AX?Ⅰ?1的主鏈?zhǔn)铅?吡喃型多糖.

2.3 AX?Ⅰ?1的單糖組成分析

采用GC?MS法分析單糖的組成，與6種單糖對照品的保留時間進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)AX?Ⅰ?1中含有鼠李糖（tR＝24.73 min）、阿拉伯糖（tR＝25.55 min）、木糖（tR＝26.21 min）、甘露糖（tR＝33.20 min）、葡萄糖（tR＝33.37 min）和半乳糖（tR＝33.76 min），其摩爾比為0.006∶14.113∶8.284∶0.116∶0.468∶1.

2.4 AX?Ⅰ?1的甲基化分析

通過對比AX?Ⅰ?1的GC?MS分析中碎片離子峰與美國佐治亞大學(xué)復(fù)合糖類研究中心（CCRC）數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ccrc.uga.edu／specdb／ms／pmaa／pframe.html）的數(shù)據(jù)（見表1）可知，AX?Ⅰ?1分支度較高，單糖殘基以表1中的幾種連接方式存在.

2.5 AX?Ⅰ?1的核磁共振分析

根據(jù)單糖組成分析、甲基化分析結(jié)果以及文獻(xiàn)［24］報道的糖基的化學(xué)位移，對AX?Ⅰ?1在1D NMR（1H NMR，13C NMR）和2D NMR［HMBC（圖2），HMQC（圖3）］中的信號進(jìn)行了歸屬.根據(jù)文獻(xiàn)［24］報道的糖基化學(xué)位移，將糖基的端基質(zhì)子信號進(jìn)行歸屬并將其分別標(biāo)記為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H.在δ 1.24處的弱吸收峰是由α?L?Rhap中甲基產(chǎn)生的［25］，但在13C NMR中δ 18.0～20.0處未發(fā)現(xiàn)甲基的吸收峰，這可能是由于α?L?Rhap的含量太小所致，由單糖組成分析結(jié)果也可發(fā)現(xiàn)Rha的含量很小，各糖基中不同的碳?xì)浠瘜W(xué)位移列于表2.

Table 1 Partially O?methylated alditol acetates of AX?Ⅰ?1

Fig．2 HMBC spectrum of AX?Ⅰ?1

Fig．3 HMQC spectrum of AX?Ⅰ?1

Table 2 Chemical shifts for the resonances of glycosyl residues of AX?Ⅰ?1 in1H and13C NMR spectra

Fig．4 Hypothetical structure of the repeat unit of AX?Ⅰ?1

根據(jù)甲基化分析結(jié)果和HMBC譜圖中的相關(guān)峰對糖基的連接順序進(jìn)行了分析.在HMBC譜圖中，相關(guān)峰δ 5.00／80.6，δ 5.00與F的1?H的δ 5.01最接近，δ 80.6與D的C2的δ 80.9最接近，因此F可能通過（1→2）苷鍵與D相連.在相關(guān)峰δ 4.90／83.8中，δ 4.90屬于D的1?H，δ 83.8屬于B的C3，因此D通過（1→3）苷鍵與B相連.在相關(guān)峰δ 4.86／84.5中，δ 4.86屬于E的1?H，δ 84.5與B的C3最接近，因此E通過（1→3）苷鍵與B相連.在相關(guān)峰δ 4.83／84.3中，δ 4.83與G，H的1?H接近，δ 84.3與B的C3最接近，因此G和H通過（1→3）苷鍵與B相連.在相關(guān)峰δ 4.83／81.3中，δ 4.83與G和H的1?H接近，δ 81.3與F的C2及C的C4接近，因此G和H分別通過（1→2）苷鍵與F相連，通過（1→4）苷鍵與C相連.在相關(guān)峰δ 4.77／81.6中，δ 4.77屬于C的1?H，δ 81.6與B的C4相近，因此C通過（1→4）苷鍵與B相連.在相關(guān)峰δ 4.90／83.0中，δ 4.90屬于D的1?H，δ 83.0與B的C3最接近，因此D通過（1→3）苷鍵與B相連.在相關(guān)峰δ 4.26／73.5中，δ 4.26屬于B的1?H，δ 73.5與C，F(xiàn)和H的C3接近，因此B可能與C，F(xiàn)和H通過（1→3）苷鍵相連.在相關(guān)峰δ 3.04／102.4中，δ 3.04屬于C的2?H，δ 102.4與A，B，G和H的C1接近，因此A，B，G和H可能通過（1→2）苷鍵與C相連.綜合單糖組成分析、甲基化分析和核磁共振分析的結(jié)果，推測AX?Ⅰ?1可能的結(jié)構(gòu)如圖4所示.其中，Ara和Xyl構(gòu)成主鏈，主鏈構(gòu)型為β型與紅外圖譜分析結(jié)果相符，其它糖組成支鏈.

2.6 黃芪藥渣多糖AX?Ⅰ各組分體外抗氧化作用分析

2.6.1 多糖AX?Ⅰ各組分對羥基自由基的清除作用 羥基自由基是氧化性最強的活性氧自由基，通過考察黃芪藥渣中多糖對羥自由基的清除能力，評價了其抗氧化性的強弱.圖5示出了4個待測樣品及Vc在不同濃度下對羥基自由基的清除作用，可見樣品濃度為0.1～0.5 mg／mL時，各組分對羥基自由基的清除作用與其樣品濃度不具有量效關(guān)系，清除能力不隨濃度的變化而變化.各組分多糖對羥基自由基的清除能力較差，多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對羥基自由基的清除率均約為5％.

Fig．5 Hydroxyl radical scavenging assay

Fig．6 Superoxide radical scavenging assay

2.6.2 多糖AX?Ⅰ各組分對超氧陰離子的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下可自氧化形成中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基，此自由基能促進(jìn)鄰苯三酚自氧化，因此通過測定某物質(zhì)對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其對超氧陰離子自由基清除作用.由圖6可知，當(dāng)樣品濃度為0.1～0.5 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除作用與濃度無正相關(guān)性.多糖AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率為40％.當(dāng)濃度為0.1 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率是陽性對照Vc的2倍，質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率略高于陽性對照Vc.

2.6.3 多糖AX?Ⅰ各組分對DPPH的清除作用DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，廣泛用于體外抗氧化實驗，樣品清除DPPH自由基的能力可反映其抗氧化活性的高低.由圖7可知，當(dāng)樣品濃度為0.1～0.5 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對DPPH的清除率約為30％.多糖AX?Ⅰ?1對DPPH的清除作用較差，清除率約為5％.

Fig．7 DPPH radical scavenging assay

2.7 黃芪多糖和黃芪藥渣多糖的差異性

黃芪多糖為細(xì)胞質(zhì)可溶性多糖，目前已分離純化出十幾種不同結(jié)構(gòu)的黃芪多糖［26］.王瑩等［27］純化出的一種黃芪多糖的主要連接方式是α?D?（1→4）?葡聚糖，在每25個葡萄糖中有1個6?O位上的分支.方圣鼎等［28］從蒙古黃芪中得3種黃芪多糖Ⅰ，Ⅱ及Ⅲ；經(jīng)鑒定黃芪多糖Ⅰ是雜多糖，由D?葡萄糖、D?半乳糖和L?阿拉伯糖組成；黃芪多糖Ⅱ和Ⅲ均為D?葡聚糖.陳啟榮等［29］從膜莢黃芪水提液中得到一種α?（1→4）葡聚糖.由此可見，黃芪多糖多為葡聚糖，少數(shù)為雜多糖且所含單糖種類較少.黃芪藥渣多糖為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖，目前該類多糖的結(jié)構(gòu)未見報道.本課題組［7］從黃芪藥渣中用KOH（1和4 mol／L）提獲得的粗多糖均為雜多糖，經(jīng)進(jìn)一步分離純化得到8個組分；并發(fā)現(xiàn)黃芪藥渣半纖維素多糖的主要成分是阿拉伯糖和木糖，還含有少量鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，單糖組成與黃芪多糖差異較大.本研究中純化出的黃芪藥渣多糖AX?Ⅰ?1為雜多糖，含有6種單糖，比黃芪多糖中單糖種類多.AX?Ⅰ?1中單糖的連接位點較多，分支度高，空間結(jié)構(gòu)比黃芪多糖復(fù)雜.

黃芪主要調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，臨床上用于抗癌、防癌及消除慢性炎癥等疾病，而多糖類是黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的主要物質(zhì).研究［30］表明，麥麩中半纖維素阿拉伯木聚糖具有較強的抗腫瘤活性，可同時提高機(jī)體特異性和非特異性免疫系統(tǒng)反應(yīng).通過增加延遲超敏反應(yīng)、增長脾細(xì)胞壽命、增加自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的活力和數(shù)量，顯著地抑制腫瘤生長，且經(jīng)大鼠長期毒性實驗顯示，阿拉伯木聚糖無毒副作用，大鼠口服半數(shù)致死量（LD50）＞36 g／kg.

3 結(jié) 論

從黃芪藥渣中分離純化出半纖維素組分AX?Ⅰ?1，AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4，研究了AX?Ⅰ?1的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及體外抗氧化活性.結(jié)果表明，AX?Ⅰ?1是一種雜多糖，含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖（摩爾比為0.006∶14.113∶8.284∶0.116∶0.468∶1）.該組分的主鏈?zhǔn)铅?吡喃型多糖，高度分支化，含有的連接方式為L?Rhap?（1→，→3，4）?L?Arap?（1→，→2，3，4）?D?Xylp?（1→，→2）?D?Manp?（1→，D?Glcp?（1→，→2，3，6）?D?Glcp?（1→，→2，3）?D?Galp?（1→和→2）?D?Galp?（1→.4種半纖維組分對羥基自由基的清除率為5％.當(dāng)濃度為0.1 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率是陽性對照Vc的2倍；當(dāng)濃度為0.2 mg／mL時，多糖AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對超氧陰離子的清除率略高于陽性對照Vc.多糖AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3和AX?Ⅰ?4對DPPH的清除率為30％.本研究為黃芪藥渣中半纖維素的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ).

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（Ed.：P，H，D，K）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.31300278），the Science and Technology Research Program Fund for Shanxi Province，China（No.20150313004?5）and the Ministry of Education PhD New Teacher Fund，China（No.20131401120006）.

Extraction，Separation，Structural Analysis and Antioxidant Activity in vitro of Arabinoxylans（AX?Ⅰ?1）from the Residue of Astragalus Root?

LIU Lei1，2，3，LI Ke2，3?，HAO Xia1，2，3，WANG Guizhen1，2，3，QIN Xuemei2，3，DU Guanhua4，ZHANG Xiang5

（1．College of Chemistry and Chemical Engineering，2．Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；3．The Efficacy of Chinese Medicine Material and New Drug Key Lab of Shanxi Province，Taiyuan 030006，China；4．Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；5．Medical College，University of Louisville，Louisville 40201，USA）

Four fractions（AX?Ⅰ?1，AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3 and AX?Ⅰ?4）from the residue of Astragalus root were extracted by sequential chemical extraction，and purified by DEAE?Cellulose 52 anion?exchange and Sepharcryl S?400 high resolution gel?permeation chromatography.A combination of chemical and instrumental analysis was performed to investigate the structural characterization and antioxidant activity of AX?Ⅰ?1.The re?sults demonstrated that AX?Ⅰ?1 was mainly composed of rhamnose，arabinose，xylose，mannose，glucose and galactose，and the molar ratio was 0.006∶14.113∶8.284∶0.116∶0.468∶1.Backbone of AX?Ⅰ?1 composed of arabinose and xylose by β?（1→2），β?（1→3）and β?（1→4）glycosidic bond.The branches were composed of（1→4）?linked?βArap，（1→3）?linked?βGalp，（1→2）?linked?βManp，and the terminal residues were αRhap，βGclp，βGalp.The four fractions had a certain scavenging effect on hydroxyl radical，superoxide anion radical and DPPH radical.When the concentration is 0.1 mg／mL，scavenging rate of AX?Ⅰ?2，AX?Ⅰ?3 and AX?Ⅰ?4 on superoxide anion is about 2 times higher than the positive control vitamin C.

Residue of astragalus root；Arabinoxylan；Purification；Structural analysis；Antioxidant activity

O629.12

A

10.7503／cjcu20160500

2016?07?13.網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016?11?11.

國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號：31300278）、山西省科技攻關(guān)計劃（批準(zhǔn)號：20150313004?5）和教育部博士點新教師類基金（20131401120006）資助.

聯(lián)系人簡介：李 科，男，博士，副教授，主要從事糖化學(xué)與糖生物學(xué)方面的研究.E?mail：like＠sxu.edu.cn