氧化鋅納米棒光電極對核黃素的光致電化學響應及應用

何艷艷，葛軍營，2，趙常志

（1.生化分析山東省重點實驗室，青島科技大學化學與分子工程學院，青島266042；2.濰坊工程職業學院應用化學與生物工程學院，青州262500）

氧化鋅納米棒光電極對核黃素的光致電化學響應及應用

何艷艷1，葛軍營1，2，趙常志1

（1.生化分析山東省重點實驗室，青島科技大學化學與分子工程學院，青島266042；2.濰坊工程職業學院應用化學與生物工程學院，青州262500）

基于核黃素在第二工作電極上的預還原，將還原型核黃素作為電子給體納入氧化鋅納米棒光電極的光致電化學反應過程，構建了一種新的光致電化學反應系統.優化了電化學制備氧化鋅納米棒光電極的方法，研究了核黃素與氧化鋅納米棒光電極的光致電化學反應機理，建立了一種測定核黃素的光致電化學分析法.在pH＝6.5的緩沖溶液中，以玻碳電極為預還原電極，在峰值波長為365 nm、能量為450 μW／cm2的光照下，在偏壓0.1 V處測得的光電流與1.00×10－5～1.00 μmol／L核黃素濃度的對數值成正比，檢出限為6.0×10－7μmol／L（S／N＝3），靈敏度為195.6 nA／lg［c（μmol／L）］.對實際樣品測定的相對標準偏差小于6.25％，回收率為99.0％～104％，常見生化物質對核黃素光電流的響應無干擾.

核黃素；氧化鋅納米棒；光致電化學分析法；四電極電化學系統

近年來，伴隨著納米材料發展的日新月異，借助于納米界面光電極的光致電化學（PEC）分析法獲得了長足的發展［1］，并在蛋白質［2］、免疫［3］和DNA［4］分析中得到廣泛應用.然而，相對于眾多可作為光敏后電子受體的納米材料，作為底物的電子給體僅有抗壞血酸、多巴胺和過氧化氫等少數化合物，導致電子受體和電子給體組成的PEC體系不多，制約了PEC分析法的發展［5］.黃素輔酶包括黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），是黃素蛋白（主要為氧化還原酶）的輔基，它可以接受2個氫而還原為FMNH2或FADH2，參與體內多種氧化還原反應［6］.黃素輔酶中的FMN是呼吸鏈的重要氫和電子傳遞體，FAD主要參與有機物如脂肪酸等的氧化脫氫.FADH2可將氫通過呼吸鏈傳遞至氧生成水，釋放能量用于三磷酸腺苷（ATP）的合成；也可將氫直接傳遞給氧而生成H2O2［7］.FMN和FAD的前體是核黃素（Riboflavin，RF），它通常由微生物和高等植物合成，動物從食物中攝取RF后，在體內磷酸化成為FMN和FAD，再構成多種酶參與氧化還原反應，促進糖、氨基酸、脂和蛋白質的代謝［8］.因而，采用核黃素作為電子給體，構建一種新的PEC反應系統，創建PEC分析的反應平臺，具有重要意義.

納米ZnO的導帶能級結構與TiO2十分相似，帶隙相同，但ZnO的電荷傳輸性能是TiO2的幾十倍，用ZnO納米材料制備的光電極更有利于注入電子到半導體的導帶，從而提高光電轉換效率［9，10］.ZnO納米結構有納米棒、納米線、納米陣列、納米管、空心納米微球和反蛋白石光子晶體（IOPCs）等多種.同ZnO納米粒子相比，ZnO納米棒（ZnONRs）因其制備成本低、無毒、電子通路大、表面積大和電子遷移率高等屬性，更適合構建電化學生物傳感器［10～13］.

本文利用四電極雙通道電化學系統，在電化學還原RF后，使其與光激發下的氧化鋅納米棒光電極（ZnONRP）發生PEC反應，構建了一種納米界面光電極與RF的PEC反應通道，并通過測量光電流實現了對RF的直接檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI?EO型光致電化學分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；配有雙工作電極光電化學池的PEAC200A型光電化學反應儀（天津艾達科技恒晟科技發展有限公司）；F?4600型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；JSM?2100F型透射電子顯微鏡和JSM 7500型場發射掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；CHI832B型雙通道電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；以ITO導電玻璃片（5.0 cm×0.8 cm，15 Ω／cm2，深圳華南湘城科技有限公司）為基底制備的ZnONRP為工作電極，玻碳電極（GCE，直徑3.0 mm）作為第二工作電極（還原電極），Ag／AgCl電極為參比電極，鉑絲為對電極組成四電極工作系統.核黃素（RF，純度＞98.5％）購于上海化學試劑有限公司；其它試劑純度均高于分析純；實驗用水為超純水（電阻率＞18 MΩ·cm）.

1.2 ZnONRP的制備

依次用乙醇、丙酮和水超聲清洗ITO導電玻璃片5 min，干燥后在其一端留出1.0 cm的一段作為電極端子，在另一端表面留出直徑為5.0 mm的空白作為ITO電極的工作面，其它部分用絕緣漆封住.將100 mL由4.5 mmol／L的Zn（NO3）2和稀HNO3組成的電解液倒入電解池中，再將電解池置于水浴鍋中恒溫至80℃，以ITO電極為工作電極，以Pt板作為對極，以Pt絲為偽參比電極，控制電解電位為－1.40 V，恒電位電解50 min后，用水洗掉表面吸附的雜質，干燥后即制得ZnONRP.

1.3 實驗方法

將測試溶液置于光電化學反應儀的光電化學池中，插入ZnONRP并使其對準光電化學池的光窗，插入GCE至光電化學池的側面電極孔中并使其距ZnONRP工作面為1.0 mm，分別連接四電極至電化學工作站.由光致電化學分析儀施加連續激發光掃描或由光電化學反應儀的LED施加紫外光（365 nm）作為激發光，設置激發光強度為450 μW／cm2，偏壓為0.10 V；同時控制GCE的還原電位為－0.40 V.先啟動電流檢測（預還原同時自動啟動），待電流趨于平穩后，開啟光閘，記錄ZnONRP的光電流?時間曲線.

2 結果與討論

2.1 ZnONRP制備條件的優化和表征

Fig．1 SEM image of the cross?section of ZnONRPInset is the surface photography of ZnONRP.

Fig．2 SEM image of the cross?section of ITO electrode

ZnO納米材料的制備方法較多，由不同的方法制得的納米ZnO的結構和性能各異.與其它方法相比，電化學沉積法具有膜厚和形貌可控、速度快、成本低、環保且易于實現實驗室向規模化生產的轉變等優點［14］.通過電極反應使ZnO沉積在ITO電極上形成ZnONRs層，ZnO的沉積量會顯著影響ZnONRP的性能.電沉積ZnO的量太少，光電化學反應弱，靈敏度低，穩定性也較差；而沉積量過多，ZnONRs膜過厚，傳質阻力增大，響應遲鈍，靈敏度不增反降［15］.由于ZnONRs層的厚度與Zn（NO3）2的初始濃度、沉積電位和時間密切相關，實驗中通過在100 mL電解液中調節Zn（NO3）2的濃度范圍為2.0～5.0 mmol／L，沉積電位和時間分別在－1.2～－1.5 V和1500～4000 s，考察了它們對ZnONRE性能的影響，發現Zn（NO3）2的初始濃度為4.5 mmol／L，沉積電位控制在－1.40 V，沉積時間為3000 s時，制得的ZnONRP的光電流響應最明顯，且重現性較好.在ZnONRP表面有乳白色膜生成（圖1插圖），對比ZnONRP（圖1）和ITO電極（圖2）斷面的掃描電子顯微鏡照片可見ZnO納米棒的寬度約為120 nm、長度約為530 nm，呈棒狀堆積在ITO電極表面.ZnONRP表面的XRD譜圖（圖3）中34.50°處的衍射峰為ZnO的（002）主峰，非常接近于ZnO六邊纖鋅礦結構（34.421°）［11］.另外，譜圖中還存在強度低于（002）晶面強度的（100），（101）和（103）3個晶面的納米ZnO衍射峰，表明ZnONRs已沉積在ITO電極的表面.

Fig．3 XRD pattern of ZnONRP surface

2.2 預還原引導RF在ZnONRP上的光致電化學反應

從分子結構上看，RF分子中存在共軛雙鍵，具有剛性的平面構造和發生氧化還原反應的位點，具有良好的光化學和電化學活性.然而，由于RF的氧化電位遠低于氧的還原電位，所以通常水溶液中的RF處于氧化態.圖4示出了RF在原始狀態（曲線a）和還原后（曲線b）在玻碳電極上的循環伏安曲線，可見初始狀態的RF僅出現還原峰（曲線a，約－0.42 V）；在經過電化學還原后，才出現氧化峰（圖4曲線b）.處于氧化狀態的RF在波長520 nm處有較強的熒光；在還原態時，RF異咯嗪環上的N5吸收質子成為季胺，進一步吸收1個電子和1個質子，成為二氫化物（RFH2）后，原有的熒光會消失［16］.RF溶液的熒光光譜（圖5）顯示，經電化學還原一段時間后，RF的熒光強度（圖5譜線b）比其原始狀態（圖5譜線a）明顯減小；將還原后的RF置于空氣中，會被氧化而失去電子，其熒光強度得以恢復，表明RF的還原態RFH2通常很難存在于水溶液中.因此，只有使用ZnONRP附近的第二工作電極GCE，先還原RF分子，使其成為電子供體，才有可能被光激發的納米ZnO氧化而發生PEC反應.

Fig．4 Cyclic voltammograms of RF solution（1．00×10－4mol／L）before（a）and after electrochemical reduction（b）Inset is the structural formula of RF.

Fig．5 Fluorescence spectra of RF solution（1．00×10－6mol／L）before（a）and after electrochemical reduction（b）

納米ZnO作為一種重要的氧化物半導體材料，在室溫下禁帶寬度為3.37 eV，激子結合能高達60 MeV.在365 nm的光照下，ZnONRs價帶的電子會被激發至導帶，同時留下帶正電的空穴［10］；當其導帶上的電子轉移到電極上時，經GCE還原RF產生的RFH2的電子會立即注入ZnONRs價帶上的空穴而被氧化，產生陽極光電流［圖6（A）］.繼而RF不斷被GCE還原，持續生成電子供體RFH2，使得PEC反應不間斷.相對于納米ZnO電子?空穴對復合的光電流［圖6（B）譜線a］和未經過GCE還原的RF［圖6（B）譜線b］，經GCE還原的RF產生了1個明顯增強、連續且穩定的光電流［圖6（B）譜線c］.通過測量光電流的強度即可實現對RF的直接檢測.

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 電解液pH值對光電流響應的影響 RF是有機堿，它的還原和氧化涉及到質子的得失，電解液的pH值會影響光電化學反應.由于光電流響應關聯到基質的還原和氧化2個因素，所以基于實驗結果確定電解液的pH值是比較科學的選擇.在pH＝5.5～8.0的范圍調節電解液的pH值，發現隨著磷酸鹽緩沖溶液pH值的增大，光電流隨之增大；但當pH＞6.5后，光電流逐漸降低；最后確定在pH＝6.5的電解液中可獲得最大的光電流響應.

Fig．6 Photoelectrochemical response mechanism of RF on ZnONRP（A）and photocurrent responses（B）of blank solution（a），the unreduced RF（b）and reduced RF（c）on ZnONRP

2.3.2 偏壓對光電流響應的影響 納米ZnO是一種具有光電活性的無機材料，施加在ZnONRP上的電極電位會影響納米ZnO的電子狀態，因而偏壓是與光電流響應相關的重要因素.考慮到體系中存在諸多電活性物質以及過電位的影響，實驗中采用逐次調大偏壓的方法來獲得合適的偏壓.固定其它實驗條件不變，當從－0.20到0.20 V每隔0.05 V順次調高偏壓時，觀察到光電流隨之增大.當設定的偏壓大于0.10 V時，光電流強度不再明顯增大.因此，實驗中將偏壓設定在0.10 V.

2.3.3 還原電位對光電流響應的影響 由圖4（A）可知，RF需經ZnONRP附近的第二工作電極GCE還原成RFH2，才能被納米ZnO價帶上的空穴氧化，從而產生陽極光電流.圖2顯示，水溶液中RF的還原峰約為－0.42 V.固定其它實驗條件不變，當從－0.30到－0.50 V每隔0.05 V順次調低電位時，觀察到光電流隨之增大.當設定的還原電位介于－0.40和－0.45 V之間時，光電流強度不再明顯增大.因此，實驗中將還原電位固定在－0.40 V.

2.4 ZnONRP對核黃素的光電流響應

基于光作用下的電化學過程而發展起來的PEC分析法一般通過檢測光電流定量基質的濃度.在優化的測試條件下，測得ZnONRP對RF的光電流響應如圖7所示.隨著基質濃度的增加，光電流隨之增大，在RF的濃度為0.10 μmol／L處出現拐點，然后逐漸放緩，呈對數增加的態勢.經過對基質濃度作對數變換，在1.00×10－5～1.00 μmol／L的濃度范圍內，光電流強度與RF濃度的對數值成正比，與相關系數R2＝0.996，檢出限為6.00×10－7（S／N＝3），靈敏度為195.6 nA／lg［c（μmol／L）］.與毛細管電泳［17］、液相色譜［18］、熒光［19］和電化學分析技術［20］相比，PEC分析法具有響應范圍寬、靈敏度高、成本較低和操作簡便的優點.

Fig．7 Photocurrent responses to various concentration of RFs（A）and response curve（B）（A）From left to right，cRF／（μmol·L－1）：0，1.00×10－5，1.00×10－4，1.00×10－3，1.00×10－2，0.10，0.50，1.00.（B）Inset is the calibration curve on the photocurrent responses to concentration logarithm.

2.5 生化物質對光電流響應的影響

在最佳實驗條件下，以測量誤差在5％以內為標準，考察了一些生化物質對RF光電流響應的影響.分別將5.00 μmol／L的葡萄糖、抗壞血酸、檸檬酸、多巴胺，維生素A，B1，B6，B12和E加入到電解液中，按實驗方法測定，未觀察到相應的光電化學響應.再分別將0.50 μmol／L的各種維生素或化合物加入到含有1.00×10－2μmol／L RF的試液中，按實驗方法測定，基質的光電化學響應沒有超過2.5％的變化，說明本方法對RF有很好的選擇性.另外，還考察了非電活性蛋白質可能產生的影響.經在1.00×10－2μmol／L的RF溶液中添加5.0 μg／mL牛血清白蛋白的實驗，按95％可信度計算，干擾值＜1.95S.

2.6 ZnONRP的重現性和穩定性

在測試過程中，第二工作電極GCE在還原RF時可能產生鈍化，從而影響測定的重現性和穩定性.圖8示出了連續10次測定同一濃度RF的同時雙電流響應實驗結果，可見GCE上RF的還原電流無明顯波動，ZnONRP的光電流信號穩定性良好.

Fig．8 Reduction current curve of RF at GCE（a）and photocurrent response curve of RF at ZnONRP（b）

重復測定1.00×10－2μmol／L RF的實驗結果顯示，同一支ZnONRP測定7次的相對標準偏差（RSD）＜3.56％，連續重復測定20次的RSD＜3.82％；按相同方法制備的5支工作電極測定相同濃度RF的RSD＜4.65％.ZnONRP在干燥避光環境下保存10 d后，對同濃度基質的光電流強度僅比初次測量減少了4％，保存30 d后光電流響應仍能保留在93％.雖然濕潤避光保存的效果稍差，但保存30 d后光電流響應仍然不低于初次測量的90％.ZnONRP的良好穩定性顯示出采用電化學方法在ITO電極表面制備ZnO NRs的優點.

2.7 電極的分析應用

將3種市售小米分別在研缽中碾碎至粉末狀，稱取樣品粉末100.0 mg溶解于100 mL稀NaOH溶液中，充分攪拌，于暗處靜置24 h.抽濾，所得濾液配成100 mL試液，經適當稀釋和調節pH值后，測定試液中RF的量，同時進行了加標回收實驗和熒光分析法的對比分析.結果（表1）顯示，相對標準偏差＜6.25％，回收率為99.0％～104％.

Table 1 Determination results of the riboflavin in millet

3 結 論

采用四電極雙通道電化學系統，先將氧化態的RF還原為電子供體RFH2，繼而使其與ZnONRP發生PEC反應，建立了以RF為電子供體，ZnONRP為電子受體的PEC反應平臺.優化了實驗條件，測定了RF的響應范圍和靈敏度，建立了一種新的RF分析法.與其它方法相比，本文方法具有修飾電極制備簡單、可控、操作簡便、檢測范圍寬和靈敏度高的特點.若將其應用于黃素輔酶相關蛋白質的檢測，會進一步拓展光致電化學分析法在生化領域的應用.另外，由于不是所有的小分子都在電極上有還原性，并且它們的還原電位也不同，采用雙電極系統可將無法作為電子給體的物質轉變為電子給體，這就為與具有光敏和電子受體功能的光電極組成PEC系統以開展下一步研究和進一步提高PEC方法的選擇性提供了可能.

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?Support by the National Natural Science Foundation of China（No.21475072），the Open?end Fund of Key Laboratory of Sensor Analysis of Tumor Marker of Ministry of Education，China（No.SATM201503）and the Open?end Fund of State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry，China（No.SKLEAC201106）.

Photoelectrochemical Response and Application of ZnO Nanorods Photoelectrode to Riboflavin?

HE Yanyan1，GE Junying1，2，ZHAO Changzhi1?
（1．Shandong Provincial Key Laboratory of Biochemical Analysis，College of Chemistry＆Molecular Engineering，Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China；2．Institute of Applied Chemistry＆Biological Engineering，Weifang Engineering Vocational College，Qingzhou 262500，China）

In this work，based on the pre?reduction of riboflavin（RF）on the second working electrode，a new photoelectrochemical（PEC）system was fabricated by the reduced RF as an electron donor incorporated into PEC reaction process of zinc oxide nanorods photoelectrode（ZnONRP）.After optimizing the electro?chemical preparation for ZnONRP and studying the reaction mechanism of RF with ZnONRP，a PEC method for the determination of RF was developed.Under the optimized conditions of pH＝6.5，－0.40 V as pre?reduction potential，illumination at 365 nm and light energy of 450 μW／cm2，the photocurrent at bias voltage 0.1 V is proportional to the logarithm of RF concentration in the range of 1.00×10－5—1.00 μmol／L with sen?sitivity of 195.6 nA／lg［c（μmol／L）］，and the detection limit was estimated to be 6.00×10－7μmol／L（S／N＝3）.Determination results for real samples showed that the relative standard deviation is less than 6.25％and the recovery rate is 99.0％—104％.Compared with other methods for the determination of RF，the proposed method has various advantages，such as wide measurement range，high sensitivity，simple equipment and con?venient operation.And common biochemical substances were not interfering with the photocurrent response of RF.

Riboflavin；ZnO nanorods；Photoelectronchemical analysis；Four?electrode electrochemical system（Ed.：N，K）

O657.1

A

10.7503／cjcu20160522

2016?07?19.網絡出版日期：2016?11?15.

國家自然科學基金（批準號：21475072）、腫瘤標志物傳感分析教育部重點實驗室開放基金（批準號：SATM201503）和電分析化學國家重點實驗室開放基金（批準號：SKLEAC201106）資助.

聯系人簡介：趙常志，男，博士，教授，主要從事光電化學和電分析化學方面的研究.E?mail：zhaocz＠qust.edu.cn