纖維素酶產生菌YZB46的產酶條件研究

羅奉奉，莫亞玲，劉鑫泰，李雪鳳，覃玥*

（河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300）

纖維素酶產生菌YZB46的產酶條件研究

羅奉奉，莫亞玲，劉鑫泰，李雪鳳，覃玥*

（河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300）

為提高纖維素酶產生菌YZB46的產酶能力，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗篩選最佳發酵培養基組成和最佳發酵條件。結果表明，菌株YZB46的最佳發酵培養基碳源為1.5%麩皮，氮源為0.6%黃豆粉，無機鹽為0.1%MgSO4和0.4%KH2PO4；最佳發酵條件為接種量8%，發酵液初始pH 5.0，發酵溫度30℃，發酵時間72 h，在此優化的發酵條件下，菌株YZB46的產酶活力達37.75 U/mL，是優化前的2.21倍。

纖維素酶；正交試驗；酶活；優化

纖維素是自然界中用之不竭的可再生資源，其作為生產第二代生物燃料解決能源和環境問題備受許多國家的重視[1-2]。如今，工、農、林業等對纖維素廢物利用率低，簡單的處理（如焚燒等）造成資源浪費并污染環境[3]。因此篩選高產纖維素酶菌株是轉化利用纖維素資源的關鍵，目前獲得高產纖維素酶的來源主要是自然選育和誘變選育[4]，現已有從各種自然環境中篩選得到來自細菌、真菌、放線菌等微生物產纖維素酶的報道[5]，放線菌產酶能力較弱，細菌相對于真菌，具有產酶周期短、適應力強、分子操作方便等優勢[6]，受到越來越多學者的重視。而纖維素酶活性低較為普遍，其易受培養條件等因素的影響，這為規模生產的一大瓶頸[7]，因此研究各類影響酶活因素對提高纖維素酶活有重要意義。

本研究前期從桑園土壤環境中篩選得到一株產纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YZB46，該菌株有良好的遺傳穩定性，可發揮內切葡聚糖酶活性，在pH6.0、30℃條件下發酵48 h后測得酶活力為17.08 U/mL，擬通過正交試驗設計優化發酵培養基和發酵條件，以提高菌株產酶能力，對纖維素酶的進一步研究應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YZB46：本實驗室保藏菌株。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；麩皮、黃豆粉：市售，粉碎過60目篩備用；桑枝、稻草秸稈：采集自宜州桑園及郊區，粉碎過60目篩備用。

種子培養基：蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

液體發酵培養基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨5.0 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3酶標儀：美國Bio-Rad公司；Avanti J-E高速冷凍離心機：德國Beckman Coulter公司；AE240S型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S4恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；PHS-3C pH計：上海智光儀器儀表有限公司；HYG-型培養搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

取5%新鮮種子液接種于100 mL液體發酵培養基中，30℃、180 r/min搖床培養48 h，發酵液于4℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 發酵培養基優化

（1）碳源篩選：分別選取1.0%CMC-Na、麩皮、桑枝粉、稻草粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉加入液體發酵培養基替代碳源，30℃、180 r/min搖床培養48 h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（2）麩皮添加量對產酶影響：分別以0.5%～2.5%的麩皮作為碳源發酵，30℃、180 r/min搖床培養48 h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（3）氮源篩選：分別選取0.5%蛋白胨、酵母膏、黃豆粉、（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素加入液體發酵培養基替代氮源，30℃、180 r/min搖床培養48 h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（4）黃豆粉的添加量對產酶影響：分別以0.2%～1.0%的黃豆粉作氮源發酵，30℃、180 r/min搖床培養48 h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（5）MgSO4·7H2O濃度對產酶影響：在培養基中分別添加0.05%～0.30%的MgSO4·7H2O發酵產酶，30℃、180 r/min搖床培養48h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（6）KH2PO4濃度對產酶影響：在培養基中分別添加0.2%～1.0%的KH2PO4發酵產酶，30℃、180 r/min搖床培養48 h，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。

（7）正交試驗優化培養基組分：在單因素試驗的基礎上，取麩皮、黃豆粉、MgSO4含量、KH2PO4含量設計4因素3水平正交試驗，確定最優產酶培養基配方。正交試驗因素與水平見表1。

表1 培養基組分優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 發酵條件優化

經過發酵培養基組分優化后，在最適的培養基組合條件下進行發酵產酶條件研究，以5%的接種量在初始pH 6.0、30℃條件下發酵48 h為基礎條件進行產酶條件單因素試驗，設置不同的初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）、發酵時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）、接種量（2%、5%、8%、11%、14%、17%）進行單因素試驗，測定CMCase酶活力，每組試驗均設3次重復。根據單因素試驗結果，設計以初始pH、發酵溫度、發酵時間、接種量為評價因素的4因素3水平正交試驗，確定最優發酵條件。正交試驗因素與水平見表2。

表2 發酵條件優化正交試驗設計Table 2 Design of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.4 纖維素酶活力（CMCase）測定

采用DNS法測定酶反應體系產生的葡萄糖[4]。葡萄糖標準曲線制作：取1 mg/mL的葡萄糖溶液2 mL，加1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴后，迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至20 mL，在波長540 nm處測吸光度值，以葡萄糖含量（mg）和吸光度值（OD540nm值）作標準曲線。

CMCase測定：取粗酶液0.5 mL，加入經40℃預熱的含1.5 mL 0.5%CMC-Na的檸檬酸緩沖液（pH5.0，0.05 mol/L）中，混勻，40℃水浴30 min后，立即加1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴后，迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至20 mL，以滅活的粗酶液為對照組，在波長540 nm處測吸光度值，對照標準曲線計算酶活。

酶活定義：在上述條件下，每1 min催化底物CMC-Na產生1 μmol的葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位，U/mL。

式中：m為葡萄糖標準曲線計算得葡萄糖質量，mg；5.56為1 mg葡萄糖的物質的量，μmol；n為酶液稀釋倍數；t為反應時間，min；V為反應酶量，mL。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 不同碳源對菌株YZB46產酶影響

由圖1可知，當以CMC-Na為碳源時，菌株的酶活力最高[8]，以麩皮為碳源時，酶活力僅次于CMC-Na，桑枝粉和稻草粉可能富含較多的木質素，阻礙菌株對纖維素的利用。從經濟利用上考慮，選擇麩皮作發酵培養基的最佳碳源。

圖1 碳源對菌株YZB46產酶的影響Fig.1 Effect of carbon sources on CMCase of strain YZB46

2.1.2 麩皮添加量對菌株YZB46產酶影響

圖2 麩皮添加量對菌株YZB46產酶的影響Fig.2 Effect of wheat bran addition on CMCase of strain YZB46

由圖2可知，隨著麩皮添加量的增加，酶活性呈先上升后下降的趨勢，當添加1.5%的麩皮時，酶活達26.07 U/mL，繼續增加麩皮量酶活呈現下降趨勢。這與陳士成等[9]的報道類似，麩皮可誘導產酶。因此選擇麩皮添加量1.0%、1.5%、2.0%進行正交試驗。

2.1.3 不同氮源對菌株YZB46產酶影響

圖3 氮源對菌柏油YZB46產酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on CMCase of strain YZB46

由圖3可知，黃豆粉的產酶活力最高，相對于其他氮源，其來源成本低廉，適合作發酵產酶氮源。無機氮源中，（NH4）2SO4比NH4NO3利用效果更好，因NH4+相對于NO3-更易于微生物吸收[10]。但無機氮源的產酶能力較有機氮源的產酶能力低，因此選擇黃豆粉作發酵培養基的最佳氮源。

2.1.4 黃豆粉添加量對菌株YZB46產酶影響

圖4 黃豆粉添加量對菌株YZB46產酶的影響Fig.4 Effect of soybean meal addition on CMCase of strain YZB46

由圖4可知，隨著黃豆粉添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢。當添加0.6%的黃豆粉時，CMCase活力達最高，為28.51U/mL。因此選擇黃豆粉添加量0.4%、0.6%、0.8%進行正交試驗。

2.1.5 MgSO4·7H2O添加量對菌株YZB46產酶影響

圖5 MgSO4·7H2O添加量對菌株YZB46產酶的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O addition on CMCase of strain YZB46

由圖5可知，隨著MgSO4·7H2O添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢。但對產酶影響變化不大，在0.10%～0.20%范圍內CMCase活力都較高。因此選擇MgSO4·7H2O添加量0.10%、0.15%、0.20%進行正交試驗。

2.1.6 KH2PO4添加量對菌株YZB46產酶影響

圖6 KH2PO4添加量對菌株YZB46產酶的影響Fig.6 Effect of KH2PO4addition on CMCase of strain YZB46

由圖6可知，隨著KH2PO4添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢。KH2PO4在添加量為0.4%的時候酶活力最高，因此選擇KH2PO4添加量0.2%、0.4%、0.6%進行正交試驗。

2.1.7 培養基組分優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗L9（34）對菌株進行產酶測定，試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 培養基組分優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

表4 培養基組分優化正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results for medium formula optimization

由表3、表4可知，培養基成分中，各因素對纖維素酶活的影響大小順序為麩皮＞黃豆粉＞KH2PO4＞MgSO4，麩皮對酶活有顯著影響，從極差分析得出，最佳培養基組分組合為A2B2C1D2，即麩皮1.5%，黃豆粉0.6%，MgSO40.1%，KH2PO40.4%，該組合并未在正交表中，因此需將此次組合和試驗中最大酶活的組合A2B3C1D2比較，結果見表5。

表5 不同組合發酵結果比較Table 5 Fermentation results comparison of different combinations

由表4可知，通過極差分析得到的組合A2B2C1D2的發酵產纖維素酶活（35.25 U/mL）優于正交試驗設計的組合A2B3C1D2（33.64 U/mL）。

2.2 發酵條件優化

2.2.1 不同初始pH對菌株YZB46產酶影響

圖7 初始pH對菌株YZB46產酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on CMCase of YZB46

由圖7可知，隨著初始pH值的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢。在初始pH 6.0酶活達最高，而堿性條件下對產酶有較大的影響，呈急劇下降趨勢，說明弱酸性條件下有利于產酶。因此選擇初始pH 5.0、6.0、7.0進行正交試驗。

2.2.2 不同發酵溫度對菌株YZB46產酶影響

圖8 溫度對菌株YZB46產酶的影響Fig.8 Effects of temperature on CMCase of strain YZB46

由圖8可知，隨著發酵溫度的升高，酶活力呈先上升后下降趨勢，在30℃時達到最高，說明高溫不利于菌株產酶。因此選擇25℃、30℃、35℃進行正交試驗。

2.2.3 不同發酵時間對菌株YZB46產酶影響

圖9 發酵時間對菌株YZB46產酶的影響Fig.9 Effects of fermentation time on CMCase of strain YZB46

由圖9可知，在24～144 h內，前期菌體生長，產酶量少，呈逐步升高趨勢，在72 h時達到產酶最高，72 h后產酶逐步下降，原因可能是營養物減少，有害代謝物增多，影響菌株的生理活性，因此選擇發酵時間48 h、72 h、96 h進行正交試驗。

2.2.4 不同接種量對菌株YZB46產酶影響

圖10 接種量對菌株YZB46產酶的影響Fig.10 Effects of inoculum on CMCase of strain YZB46

由圖10可知，隨著接種量增加，酶活力逐步升高，接種量為8%時酶活力最高，繼續增加接種量，酶活開始下降，接種量過高導致溶氧不足，不利于菌株產酶，因此選擇接種量5%、8%、11%進行正交試驗。

2.2.8 發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計初始pH、發酵溫度、發酵時間、接種量的4因素3水平正交試驗，試驗結果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表6、表7可知，發酵條件各因素對YZB46產纖維素酶的影響大小為：發酵溫度＞發酵時間＞接種量＞初始pH，其中溫度對酶活有顯著影響，得到最優組合為A1B2C2D2，即初始pH5.0，溫度30℃，發酵72 h，接種量為8%，此組合在正交表中，酶活為37.69 U/mL。

表7 發酵條件優化正交試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test results for fermentation conditions optimization

在最佳發酵培養基組分和發酵條件下進行驗證試驗，重復3次試驗，結果見表8。

表8 最優組合實驗驗證結果Table 8 Verification results of the optimal combination

由表8可知，經過發酵培養基組分和發酵條件的優化，菌株YZB46的產酶活力達37.75 U/mL，在發酵優化后產酶有所提升，從原來的17.08 U/mL提升至37.75 U/mL，是優化前的2.21倍。

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗優化了纖維素酶產生菌YZB46的產酶能力，菌株YZB46的最佳發酵培養基碳源為1.5%麩皮，氮源為0.6%黃豆粉，無機鹽為0.1%MgSO4和0.4%KH2PO4；最佳發酵條件為接種量8%，發酵液初始pH 5.0，發酵溫度30℃，發酵時間72 h，在此條件下菌株YZB46的產酶活力達37.75 U/mL。菌株YZB46產酶條件屬弱酸性、低溫產酶[11]，發酵時間相對較短，低溫短時使酶在工業應用上具有一定優勢。關于桑園土壤來源的芽孢桿菌產酶研究鮮見報道，桑園中桑樹常因剪枝而產生大量桑枝條，而初步研究菌株YZB46的纖維素酶活力對桑枝粉的降解能力較低，這有待進一步探索[12]。獲得高產酶的方法可以通過菌種篩選、培養條件優化、基因改造等途徑，自然選育菌種穩定性好，因此，本研究可在發酵條件優化基礎上，進一步探究環境因素的影響，通過多菌混合發酵[13]、誘變[14-16]或分子改造等方法開發菌株YZB46的產酶潛能。

[1]LIMAYEM A,RICKE S C.Lignocellulosic biomass for bioethanol production:current perspectives,potential issues and future prospects[J]. Prog Energ Combust,2012,38:449-467.

[2]YANG J K,ZHANG J J,YU H Y,et al.Community composition andcellulase activity of cellulolytic bacteria from forest soils planted with broad-leaved deciduous and evergreen trees[J].Appl Microbiol Biot, 2014,98:1449-1458.

[3]SINGH A,PANT D,KORRES N E,et al.Key issues in life cycle assessment of ethanol production from lignocellulosic biomass:challenges and perspectives[J].Bioresource Technol,2009,101(13):5003-5012.

[4]劉延娟，劉守成，李娟.響應面法優化產纖維素酶菌株的產酶條件研究[J].綠色科技，2016（4）：187-190.

[5]KUHAD R C,GUPTA R,SINGH A.Microbial cellulases and their industrial applications[J].Enzyme Res,2011,2:1-10.

[6]MAKI M,LEUNG K T,QIN W S.The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass[J].Int J Biol Sci,2009,5(5):500-516.

[7]張雪輝，唐蕊，孟春燕.纖維素酶產生菌ZJW-11培養條件的優化[J].江蘇農業科學，2014，42（12）：399-401.

[8]陸晨.高產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件的優化[D].長沙：中南林業科技大學，2012.

[9]陳士成，曲音波，張巖，等.產中性纖維素酶芽孢桿菌Y106產酶條件優化[J].應用與環境生物學報，2000，6（5）：457-461.

[10]李爭明.纖維素酶產生菌的篩選、發酵產酶條件優化及酶學特性研究[D].武漢：湖北工業大學，2014.

[11]李強，季更生，古緒頂，等.從桑樹根際土壤分離的產低溫堿性纖維素酶菌株BJ-XH及酶的特性研究[J].蠶業科學，2012，38（6）：1086-1092.

[12]王娜，張靖峰，卜杰申.不同預處理對桑樹枝條酶解效果的影響研究[J].桑蠶通報，2015，46（1）：23-27.

[13]白春燕，魏如騰，侯紅萍.多菌混合發酵產纖維素酶及生物法預處理秸稈的研究[J].中國釀造，2016，35（1）：57-61.

[14]余祖華，丁軻，候奎，等.產纖維素酶地衣芽孢桿菌的誘變選育及其產酶條件優化[J].中國畜牧獸醫，2016，43（4）：1006-1011.

[15]劉春芬，賀稚非.纖維素酶高產菌株的誘變選育[J].中國釀造，2008，27（5）：29-32.

[16]呂志偉，王瑾，張文會.地衣芽孢桿菌LCB-8的紫外誘變及優良菌株的選育[J].安徽農業科學，2011，39（32）：19995-19996.

Fermentation conditions of cellulase-producing strain YZB46

LUO Fengfeng,MO Yaling,LIU Xintai,LI Xuefeng,QIN Yue*
(College of Chemical and Biological Engineering,Hechi University,Yizhou 546300,China)

In order to improve cellulase-producing capacity of strain YZB46,on the basis of single factor experiment,the optimal medium formula and fermentation conditions were optimized through orthogonal tests.The results showed that the optimal medium formula were as follows:carbon source was wheat bran 1.5%,nitrogen source was soybean meal 0.6%,organic salt was MgSO40.1%and KH2PO40.4%,and the optimal fermentation conditions were inoculum 8%,fermentation broth initial pH 5.0,and fermentation temperature 30℃,time 72 h.Under the above conditions,the activity of cellulase reached 37.75 U/ml,which was 2.21 times higher than the control.

cellulase;orthogonal test;enzyme activity;optimization

Q939.9

0254-5071（2016）11-0117-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.024

2016-05-01

廣西高校科學技術研究項目（LX2014334）；河池學院廣西高校微生物及植物資源開發利用重點實驗室開放課題（2015HL008）；

河池學院重點科研課題（XJ2016ZD002）

羅奉奉（1986-），女，講師，碩士，研究方向為資源環境微生物。

*通訊作者：覃玥（1970-），女，教授，碩士，研究方向為微生物與植物病害。