一株苦馬豆素降解菌的分離與鑒定

賈琦珍，陶大勇，鄧 利，陳根元，王 帥

(塔里木大學 動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

?

一株苦馬豆素降解菌的分離與鑒定

賈琦珍，陶大勇，鄧 利，陳根元，王 帥

(塔里木大學 動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

旨在從小花棘豆(OxytropisglabraDC)生長環境中分離可降解其主要毒性成分苦馬豆素(Swainsonine，SW)的微生物。通過富集馴化培養，以SW為唯一碳源，從埋置小花棘豆的土壤中分離得到1株SW降解菌。形態學觀察表明該降解菌為革蘭氏陰性短小桿菌，無莢膜，無鞭毛；生理生化檢測發現該降解菌氧化酶陽性，不產吲哚，不水解淀粉；16S rDNA 序列比對分析表明該降解菌屬于假單胞菌科假單胞菌屬微生物，序列比對發現與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)同源性最高。在SW無機鹽液體培養基中培養24 h，菌株對100 mg/L SW的降解率為30.12%，延長培養時間不能提高其降解SW的能力，但可在高質量濃度SW(1 000 mg/L)的處理下生長；該降解菌在無SW刺激的條件下轉接 50 代，對100 mg/L SW的降解率無明顯影響。

苦馬豆素；小花棘豆；生物降解；假單胞菌

瘋草是豆科棘豆屬、黃芪屬和苦馬豆屬等有毒植物的總稱，廣泛分布于世界各地，具有繁殖系數高、抗逆性強、返青早、根系發達等特點，嚴重危害草地畜牧業的發展[1]。國內外研究[2-3]表明，因瘋草大量蔓延導致草場生態平衡受到破壞，天然草地退化嚴重，目前每年有700多萬只放牧家畜因采食瘋草中毒，嚴重的可導致死亡。苦馬豆素(Swainsonine，SW)是瘋草的主要毒性成分[4]，通過影響動物的繁殖系統、神經系統等導致動物中毒；但瘋草具有豐富的氨基酸、微量元素和能量物質，可作為潛在的牧草資源，如能有效利用，既可促進畜牧業的可持續發展，又有利于環境保護[5]。目前瘋草的防除主要有物理方法(人工挖除、焚燒等)、化學方法(除草劑滅除)和生物方法(以草治草、以蟲治草、以菌治草、以畜治草)等[6]，研究最多、最有成效的方法是SW的微生物降解，從而使瘋草去除毒性得到利用。本試驗擬從埋置瘋草的土壤中富集篩選，找到高效穩定降解 SW 的菌株，為瘋草的開發利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

小花棘豆于2014年9月采自新疆克州阿合奇縣色帕巴依鄉，由塔里木大學動物科學學院草業科學學科組鑒定，氣相色譜內標法測定小花棘豆樣品中SW質量分數為(19.52±2.78) mg/kg，確定為瘋草[5]；采集小花棘豆生境地下0～30 cm土壤，密封后帶回。

SW標準品(質量分數>99%，生產批號0B003616)，甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(me-gal，質量分數>99%，生產批號M7257)，美國Sigma-Aldrich公司；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，二者體積比為99∶1，生產批號LB62404)，美國Supelco公司；吡啶，色譜純，天津市光復精細化工研究所；TaqⅠ DNA聚合酶(1189A)、DL2000 DNA Marker(3591A)、IPTG(9030)、X-Gal(9031)等均購自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組提取試劑盒、DNA片段快速回收純化試劑盒，北京天根生化科技有限公司。其余試劑均為國產分析純。

Carry 100型紫外-可見分光光度計，美國Varian公司；CX31型生物顯微鏡， 奧林巴斯(中國)有限公司；Direct-Q3型超純水系統，美國Millipore公司；DYY-Ⅱ型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GC-C14氣相色譜儀，島津(中國)有限公司。

1.2 主要培養基

無機鹽培養基：NH4NO31.0 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO40.15 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2；固體培養基每100 mL再加入1.8 g瓊脂。

牛肉膏蛋白胨培養基(NA)：胰蛋白胨1.0 g，牛肉浸膏 0.5 g， NaCl 0.5 g，K2HPO40.1 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2 ；固體培養基每100 mL再加入2.0 g瓊脂。

普通肉湯培養基(LB)：胰蛋白胨 10 g，酵母浸膏 5.0 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2。

1.3 SW降解菌的篩選

稱取小花棘豆鮮樣10 g，埋置于采集的土壤中60 d。去除植物殘渣和砂礫等，稱取土壤10 g，加入90 mL滅菌蒸餾水，200 r/min振蕩混勻10 min。靜置后取上清液10 mL接種于90 mL液體NA培養基，37 ℃，200 r/min培養24 h。取10 mL上述培養基接種于90 mL 含50 mg/L SW的無機鹽培養基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養。每隔3 d按10%的接種量接種于新鮮的無機鹽培養基中，并逐步提高SW的質量濃度，直至1 000 mg/L。然后涂布接種于SW無機鹽固體培養基，37 ℃培養24 h后根據菌落形態進行分離純化。挑取純化菌種置于含50 mg/L SW的無機鹽液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養3 d，然后接種于斜面培養基，4 ℃保存。

1.4 SW降解菌降解能力的測定

將獲得的SW降解菌接種于含不同質量濃度(50、100、200、400、800和1 000 mg/L)SW的無機鹽液體培養基中，37 ℃培養24 h。參照文獻[7]方法，分別取100 μL培養前和培養后的培養基，加入去離子水100 μL和丙酮600 μL，超聲處理15 min 以去除培養基中的蛋白質等雜質，然后12 000 r/min離心10 min取上清液；重復3次后合并上清液，冷凍干燥得到待測樣。將待測樣與內標物甲基-α-D-吡喃甘露糖苷溶于吡啶，再與衍生劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷反應5 h后，采用氣相色譜內標法檢測SW質量濃度。其色譜條件為：進樣口溫度300 ℃，柱溫200 ℃，FID溫度280 ℃，分流比60∶1，載氣為高純H2，壓力200 kPa，進樣量為1 μL。降解率計算方法參照文獻[8]。

1.5 SW降解菌降解SW穩定性的測定

將該降解菌接入無 SW 刺激的 LB 斜面上，每隔48 h轉接1次，連續轉接50次，每隔10代按“1.4”方法檢測對100 mg/L SW的降解率。

1.6 SW降解菌的鑒定

將分離得到的SW降解菌在普通瓊脂培養基中培養48 h，依據《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，通過形態觀察、革蘭氏染色和生理生化試驗進行初步鑒定；然后提取降解菌DNA，采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，引物為27f-1492r，并轉入E.coliDH5α，藍白斑篩選后，挑取白色克隆培養送TAKARA(大連)有限公司測序、拼接。將得到的序列用NCBI在線BLAST進行同源性比對。用MEGA6.0軟件進行序列比對，并進行同源性和系統學分析，構建進化樹并判斷其分類。

1.7 數據分析

試驗數據使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 SW降解菌的篩選

根據菌落形態，試驗初步分離得到28株菌。以SW為唯一碳源，細菌在無機鹽培養液中培養3 d后，通過氣相色譜法測定得到1株具有降解SW能力的菌，命名為XJAHQ26菌株。

2.2 降解SW能力的測定

由表1可知，當SW質量濃度處于50～1 000 mg/L時，菌株XJAHQ26均具有一定的降解能力。其中，在37 ℃、200 r/min條件下培養24 h，對質量濃度為100 mg/L SW的降解率(30.12%)最高，顯著高于對質量濃度為50 mg/L SW的降解率(P<0.05)，極顯著高于對質量濃度為400、800和1 000 mg/L SW的降解率(P<0.01)，但與對質量濃度200 mg/L SW的降解率差異不顯著(P>0.05)。表明菌株XJAHQ26對低質量濃度(≤200 mg/L)SW的降解效果較好，但對較高質量濃度SW(≥400 mg/L)的降解效果較差。

表1 不同SW質量濃度下菌株的降解率

2.3 培養時間對菌株降解SW能力的影響

由表2可知，培養24、48、72、96和144 h時，菌株XJAHQ26對100 mg/L SW的降解率分別為30.12%、33.20%、33.87%、33.73%和33.84%，表明延長培養時間可提高菌株XJAHQ26對100 mg/L SW的降解率，但與培養24h時的降解率差異均不顯著(P>0.05)。即延長培養時間并不能有效提高菌株XJAHQ26對100 mg/L SW的降解率，而且試驗72 h后，XJAHQ26對SW的降解率趨于穩定。

表2 不同培養時間下菌株對SW的降解率

2.4 SW降解菌降解SW的穩定性

如表3所示，轉接10、20、30、40和50次時菌株XJAHQ26對100 mg/L SW的降解率分別為30.41%、31.25%、30.64%、30.13%和30.07%，5次測定的降解率差異均不顯著(P>0.05)。表明菌株XJAHQ26具有較好的降解穩定性，在瘋草的脫毒利用方面具有一定的研究價值。

表3 不同轉接次數的菌株SW降解率

2.5 降解菌的形態及生理生化鑒定結果

通過菌落形態觀察和革蘭氏染色，菌株XJAHQ26為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，無莢膜。在LB平板上為乳白色圓形菌落，邊緣整齊，表面光滑，如圖1和圖2所示。

細菌的部分生理生化特征為：吲哚試驗陰性、鞭毛染色陰性、葡萄糖發酵陰性、蔗糖發酵陰性、乳糖發酵陰性、甘露醇發酵陰性、淀粉水解陰性、硝酸鹽還原陰性、硫化氫生成陰性、過氧化氫酶反應陽性、接觸酶反應陰性、明膠水解試驗陰性、甲基紅試驗陰性、苯丙氨酸試驗陽性、精氨酸試驗陽性、脯氨酸試驗陽性。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，初步判斷為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

圖1 菌株XJAHQ26菌落形態

2.6 降解菌的分子鑒定結果

圖2 菌株XJAHQ26的革蘭氏染色

測序結果表明菌株XJAHQ26的16S rDNA序列長度為1439bp，將菌株的16S rDNA序列與NCBI中核酸16S rDNA序列進行BLAST比對，發現其與假單胞菌屬(Pseudomonas)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的一致性為100%。選取與其相近的部分菌株16S rDNA序列利用 MEGE 6.0 軟件建立無根進化樹(圖3)，確定該菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。

圖3 基于菌株XJAHQ26和親源關系相近菌株的16S rDNA序列的無根系統發育樹

3 討 論

中國現有黃芪屬植物278種，棘豆屬植物120種，苦馬豆屬植物1種，其中新疆分布黃芪屬植物81種，約占全國總種數的29%；棘豆屬植物97種，約占中國總種數的81%，苦馬豆屬植物1種[4]。新疆牧區草原分布的瘋草(主要毒性成分為SW)共20種，其中優勢種8種，分布面積已超過100萬hm2，并且每年還在以3.3%～3.5%的速度蔓延，現已嚴重影響新疆草原畜牧業的可持續發展[6]。瘋草的防除方法目前主要有人工挖除、化學滅除和生物防除等，其中，生物防除是通過生物間的互相制約關系進行防除，具有較好的防除效果與生態效應。比如在瘋草滋生的地段，通過改變土壤氮、磷水平及補播一些適宜的優良牧草，或采用封灘育草和草地施肥及灌溉等措施，使草地上優良牧草增多，瘋草減少；還可利用家畜或昆蟲對瘋草的專嗜性進行滅除；也可在瘋草含毒量較低的生長階段適時適度放牧，即可減少瘋草數量，又可利用瘋草中的營養物質。應用生物降解手段如培育SW降解菌也為解決家畜瘋草中毒提供一條新的途徑。

利用微生物進行毒素降解具有成本低、對環境影響小、可最大限度降低污染物濃度、可用于其他技術難以應用的場地等優點。國內研究人員對SW的微生物降解已進行大量的前期工作。李勤凡[10]從冰川棘豆生長的環境土壤中分離得到1株能降解SW的菌，其對50 mg/L SW的降解率為14.2%。Zhao等[11]通過富集馴化培養，從甘肅棘豆生長環境中的土壤中分離出4株SW降解菌，對SW的降解率分別為100%、100%、99.03%和 97.80%，鑒定發現1株為醋酸鈣不動桿菌，1株為多食鞘氨醇桿菌，其余2株為嗜麥芽寡養單胞菌；但4株菌降解 SW 的穩定性均較差，不便于對 SW 降解機制及應用的研究。Wang等[12]從埋置黃花棘豆的土壤中分離得到1株SW降解菌，經鑒定與解硝基鄰甲氧基苯酚節桿菌同源性最高，最終命名為ArthrobacternitroquajacolicusHW08；該菌連續在無SW刺激的條件下轉接100次，仍能在4 h內降解300 mg/L的SW。胡延春等[8]從甘肅棘豆內生細菌中篩選到1株SW降解菌，鑒定為缺陷短波單胞菌，命名為BrevundimonasdiminutaAb，但其對100 mg/L SW的降解率僅為11.577 1%。本試驗獲得1株可降解SW的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，對200 mg/L 以下質量濃度的SW均具有較高的降解率，而且該株菌在無SW刺激的條件下轉接50次，SW降解能力無顯著下降，表明具有較好的穩定性。目前，假單胞菌主要應用于有機物污染和重金屬污染的生物修復，尚未有假單胞菌屬降解生物堿的報道，本試驗首次發現惡臭假單胞菌具有降解SW的能力，為SW降解菌的篩選提供新的方向。

SW的降解途徑、降解產物及是否對動物具有毒性已有部分結論，SW降解菌的實驗室培養、降解酶的分離、結構測定及編碼酶基因的測序等方法也趨于完善。在此基礎上，可以進一步構建出基因工程菌或開發出酶制劑，應用到生產實踐中解決瘋草中毒問題。Wang等[13]認為菌株YLZZ-2降解SW的能力與質粒有關，質粒消除則降解能力就喪失。但胡延春等[14]制備節桿菌ArthrobacternitroquajacolicusHW08的質粒，檢測發現無質粒存在，表明其降解SW的功能基因存在于基因組中。國內外研究[13-15]表明，假單胞菌降解有機污染物質的基因多數是在質粒上，但其降解SW的功能基因存在于質粒還是基因組中，仍有待于進一步研究。

4 結 論

從小花棘豆生境土壤中篩選得到1株SW降解細菌，通過形態學、生理生化及分子生物學方法鑒定，初步判斷該菌為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，命名為XJAHQ26。該菌在37 ℃、200 r/min條件下培養24 h，對質量濃度為100 mg/L SW的降解率為30.12%，延長培養時間并不能明顯提高其降解SW的能力，但該菌能耐受高質量濃度(1 000 mg/L)的SW，而且具有較好的降解穩定性。

Reference：

[1]夏晨陽,劉建枝,王敬龍,等.西藏自主研發預防劑對瘋草中毒藏山羊血液生化指標影響研究[J].西南農業學報,2015,28(1):419-422.

XIA CH Y,LIU J ZH,WANG J L,etal.Study on effect of Tibet locally researched and developed prophylactic on blood biochemical indexes of goats with locoweed toxicosis[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,2015,28(1):419-422(in Chinese with English abstract).

[2]YANG G D,GAO R,WANG Y,etal.Determination of swainsonine in the endophyticUndifilumfungi by high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detecto[J].Toxicon,2012,60(1):44-49.

[3]陳根元,賈琦珍,潘伊微,等.家兔苦馬豆素多克隆抗體的制備及其對小花棘豆中毒的治療效果[J].西北農業學報,2014,23(1):23-29.

CHEN G Y,JIA Q ZH,PAN Y W,etal.Preparation of rabbit polyclonal antibody against swainsonine and its effects on poisoning byOxytropisglabraDC[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2014,23(1):23-29(in Chinese with English abstract).

[4]吳晨晨,趙寶玉,路 浩,等.中國主要瘋草中苦馬豆素的動態變化規律[J].西北農業學報,2014,23(5):51-58.

WU CH CH,ZHAO B Y,LU H,etal.Dynamic change of swainsonine in major locoweed spieces in China [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2014,23(5):51-58(in Chinese with English abstract).

[5]張蕾蕾,余永濤,何生虎,等.不同因素對瘋草內生真菌合成苦馬豆素的影響[J].畜牧獸醫學報,2015,46(1):163-173.

ZHANG L L,YU Y T,HE SH H,etal.Influence of different factors on swainsonine production in fungal endophyte from locoweed[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2015,46(1):163-173(in Chinese with English abstract).

[6]鄧 利,謝 麗,何 雯,等.小花棘豆防除方法的研究進展[J].新疆畜牧業,2015(2):10-12.

DENG L,XIE L,HE W,etal.Research progress of methods of control inOxytropisglabraDC[J].XinjiangHusbandry,2015(2):10-12(in Chinese).

[7]王 帥,陳根元,胡建軍,等.氣相色譜內標法測定南疆地區小花棘豆中苦馬豆素含量[J].新疆農業科學,2011,48(4):723-728.

WANG SH,CHEN G Y,HU J J,etal.Determination of Swainsonine inOxytrpisglabraDC in South Xinjiang by internal standard gas chromatography[J].XinjiangAgriculturalSciences,2011,48(4):723-728(in Chinese with English abstract).

[8]胡延春,劉 鵬,趙春蕊,等.甘肅棘豆中降解苦馬豆素內生細菌的篩選與鑒定[J].浙江大學學報(農業與生命科學版),2011,37(5):521-526.

HU Y CH,LIU P,ZHAO CH R,etal.Screening and identification of endophytic bacteria ofOxytropiskansuensisBunge for swainsonine degradation[J].JournalofZhejiangUniversity(Agricultural&LifeSciences),2011,37(5):521-526(in Chinese with English abstract).

[9]GARRITY G M,BELL J A,LILBUM T G.Taxonomic outline of the prokaryotes[M]//Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,2nd ed,Release 5.0.New York:Springer-Verlag,2004:567-590.

[10]李勤凡.冰川棘豆毒素的毒性及細菌降解研究[D].陜西楊凌:西北農林科技大學,2005.

LI Q F.Studies on toxicity and bacteria degradation ofOxytropisglacialistoxins[D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2005(in Chinese with English abstract).

[11]ZHAO X H,HE X,WANG J N,etal.Biodegradation of swainsonine byAcinetobactercalcoaceticusstrain YLZZ-1 and its isolation and identification[J].Biodegradation,2009,3(20):331-338.

[12]WANG Y,HU Y C,WANG J H,etal.Isolation and characterization ofArthrobactersp.HW08 capable of biodegrading swainsonine[J].AfricanJournalofMicrobiologyResearch,2010,4(15):1635-1638.

[13]WANG Y,HU Y C,WANG J H,etal.Ultrasound-assisted solvent extraction of swainsonine fromOxytropisochrocephalabunge[J].JournalofMedicinalPlantsResearch,2011,5(6):890-894.

[14]胡延春,王 妍,楊國棟,等.節桿菌HW08降解SW相關基因的篩選與鑒定[C]// 中國畜牧獸醫學會2010年會會議論文集.長春:中國畜牧獸醫學會,2010:1550-1554.

HU Y CH,WANG Y,YANG G D,etal.Screening and identification of related genes for degrading SW fromArthrobactersp. HW08[C]// China Clinical Veterinary Meeting.Changchun:Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine,2010:1550-1554(in Chinese).

[15]IMRE A,OLASZ F,KISS J,etal.A novel transposon-based method for elimination of large bacterial plasmids[J].Plasmid,2006,55:235-241.

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Isolation and Identification of Swainsonie Degrading Bacteria

JIA Qizhen,TAO Dayong,DENG Li,CHEN Genyuan and WANG Shuai

(Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps,College of Animal Science, Tarim University, Alar Xinjiang 843300,China)

The aim of this study is to investigate the major toxin swainsonine(SW) degrading bacterial strain isolated from soil whereOxytropisglabraDC grows. Using traditional enrichment procedure, this bacterial strain was screened when SW was used as a sole carbon source, and this strain of SW-degrading bacteria was isolated from soil whereO.glabraDC embed. Morphological investigation showed that bacterial strain was Gram negative, bacillus pumilis, capsule-free and flagella-free. Physiological and biochemical results showed that bacterial strain was positive for oxidase, and negative for indoltheticum and amylolysis. 16S rDNA sequencing and blasting indicated that bacterial strain was taxonomically classified asPseudomonas. And the homology exhibited highest compared withPseudomonasputida. Its degradation rate reached to 30.12% under the circumstance of incubation on a shaker at 200 r/min and temperature at 37 ℃ within 24 hours when the concentration of SW was 100 mg/L in inorganic salt liquid medium, the capability of degrading SW could not be improved by extending cultivation time, while it could tolerate high concentration SW up to 1 000 mg/L, this strain was characteristic of degrading 100 mg/L SW after re-inoculating 50 times without stimulus of SW, Its degradation rate had no significant change. one bacterial stain was found resist to SW in this test, this bacterial stain couldbe made use for detoxification and utilization inO.glabraDC.

Swainsonine;OxytropisglabraDC ; Biodegradation;Pseudomonas

JIA Qizhen, female,master,assistant research fellow.Research area:animal pathology. E-mail:xiaxue1984521@126.com

WANG Shuai, male, master, experimentingist. Research area:forage development and utilization. E-mail:wangshuaidky@126.com

2015-07-17

2015-09-15

國家自然科學基金(31460678，31260026)；國家星火計劃(2015GA891015)。

賈琦珍，女，碩士，助理研究員，研究方向為動物病理學。E-mail:xiaxue1984521@126.com

王 帥，男，碩士，實驗師，研究方向為牧草資源開發利用。E-mail:wangshuaidky@126.com

日期：2016-10-20

S859.8

A

1004-1389(2016)10-1554-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.040.html

Received 2015-07-17 Returned 2015-09-15

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31460678,31260026) ; National Sparking Plan Project of China (No. 2015GA891015).