長葉紅砂咖啡酸-O-甲基轉移酶(RtCOMT)基因的克隆及蛋白純化

張慧榮，馮 杰，趙萍萍，王迎春

(內蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特 010021)

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長葉紅砂咖啡酸-O-甲基轉移酶(RtCOMT)基因的克隆及蛋白純化

張慧榮，馮 杰，趙萍萍，王迎春

(內蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特 010021)

長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)是內蒙古東阿拉善-西鄂爾多斯地區特有雙子葉鹽生小灌木，有極強的耐鹽抗旱性，入藥可以治療濕疹、皮炎等疾病，具有一定的藥用價值。咖啡酸-O-甲基轉移酶(RtCOMT)是一個重要的甲基化酶，主要調控木質素合成過程中中間產物及木質素的變化。基于高通量測序結果，利用RT-PCR技術克隆獲得長葉紅砂COMT(RtCOMT)基因，構建RtCOMT原核表達載pET32a-RtCOMT，并將其轉化大腸桿菌,重組陽性菌經IPTG誘導和SDS-PAGE電泳檢測。結果表明：RtCOMT基因開放閱讀框長1 023 bp，編碼340個氨基酸，推測蛋白分子質量37.24 ku，理論等電點(pI)6.71，發現該基因在大腸桿菌中正常表達得到與預期大小一致的融合蛋白。采用Ni-IDA His-Bind親和層析方法對RtCOMT重組蛋白進行純化,體外獲得目的蛋白。

長葉紅砂；COMT基因；原核表達；蛋白純化

木質素是包圍在維管束細胞和厚壁細胞壁外的一類聚合物, 主要由阿魏酸、 松柏醇和芥子醇3種單體組成，因組成單體不同,可將木質素分為紫丁香基木質素(S-木質素)，愈創木基木質素(G-木質素)和對羥基苯基木質素(H-木質素) 3種類型[1]。木質素作為植物生長發育中的一種植物次生代謝產物,不僅能維持植物結構、輸導水分和養料,同時對植物抗倒伏、抗病和抗逆性也有重要影響[2]。但木質素過高會增加工業污染, 降低動物對飼草的消化吸收率,同時也影響一些作物的品質[3]。因此,通過基因工程技術從分子水平調控木質素含量和成分的研究在生產實際中具有重大現實意義和產業前景。

木質素合成以苯丙酸起始,經過一系列羥基化、甲基化、連接、還原反應最終生成上述3種甲基化程度不同的木質素單體。木質素合成途徑中的結構基因主要包括CAD(肉桂醇脫氫酶)、C4H(肉桂酸 4-羥化酶)、CCR(肉桂酰CoA還原酶)、COMT、CCoAOMT(咖啡酰CoA氧甲基轉移酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、4CL(桂皮酰：輔酶A連接酶)等[4]。其中，咖啡酸-O-甲基轉移酶(caffeic acid-O-methyltransferase，COMT; EC 2.1.1.68)是一種重要的甲基化酶，可催化咖啡酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化分別生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇,參與 S-木質素的合成[5-6]。目前，已經從擬南芥[7]、煙草[8]、柳枝稷[9]、豌豆[10]和銀合歡[11]等不同植物中分離獲得COMT基因，對其功能進行研究結果表明，COMT通過基因表達和酶活性變化，不僅調控木質素(主要是S-木質素)合成過程中中間產物及木質素含量的變化，而且可以影響酚類等其他植物次生代謝產物的生成，在植物生長發育過程中發揮著重要作用[12]。

長葉紅砂 (Reaumuriatrigyna),又名黃花紅砂、黃花琵琶柴,隸屬于檉柳科(Tamaricaceae)琵琶柴屬(ReaumuriaLinn. ),為古地中海殘遺珍稀小灌木,是亞洲中部地區東阿拉善-西鄂爾多斯特有種,為該地區重要牧草之一[13]。該植株高10～30 cm，葉肉質，表皮內柵欄組織發達，保衛細胞細胞壁明顯加厚，葉和幼莖上均布有鹽腺，與外界進行離子交換，保持體內鹽離子組分與生存土壤的離子組分一致，具有極強的耐鹽性和抗旱性，并且其果實可以入藥治療濕疹、皮炎等疾病，具有一定的藥用價值[14]。筆者利用Illumina測序技術，對長葉紅砂進行轉錄組深度測序，搭建了長葉紅砂轉錄組信息平臺，獲得351條與次生代謝途徑相關的差異表達基因，通過基因注釋，發現長葉紅砂中黃酮類化合物的合成和代謝被顯著激活[15]。

本試驗從長葉紅砂中克隆獲得RtCOMT基因,對其序列及結構進行分析。在蛋白水平上研究RtCOMT基因功能，構建RtCOMT基因原核表達載體 pET-32a-RtCOMT,并將其轉化大腸桿菌，進行體外蛋白誘導表達。用His-Tag 親和層析柱純化,獲得目的蛋白,為進一步研究RtCOMT酶活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 長葉紅砂幼苗的培養及脅迫處理

長葉紅砂種子用w=10%次氯酸鈉浸泡15 min，然后用滅菌水沖洗3次。消毒后的種子播種在MS培養基，在室溫25 ℃，濕度70%，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強為3 000 lx條件下培養15 d。當幼苗長到約10 cm高度時，被轉移到1/2 MS培養液中，培養15 d后收獲材料迅速保存在液氮中備用。

1.2 長葉紅砂RNA提取和cDNA合成

取0.1 g長葉紅砂幼苗用液氮快速研磨，按MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa,大連,中國)試劑盒說明書進行操作，提取的RNA沉淀室溫晾干，用適量無RNase水溶解，采用超微量分光光度計檢測總RNA濃度，電泳檢測其完整性。質量好的總RNA參照Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification試劑盒中First-Strand cDNA Synthesis步驟合成長葉紅砂cDNA第一鏈。

1.3 長葉紅砂RtCOMT基因克隆

從長葉紅砂轉錄組數據庫[15]中發現注釋為COMT基因序列，設計開放閱讀框引物RtCOMT-F(5′-ATGACACTGCTGAGCG-3′)和RtCOMT-R(5′-TCAATTCTTCAAAAATTCCAT-3′)，以長葉紅砂總cDNA為模板, 按照下列體系進行擴增:cDNA 1μL,10×TransTaq○R-T buffer 5 μL,dNTP (2.5 mol/L) 4 μL,TransTaq○R-T DNA Polymerase(2.5 U/μL) 1 μL,10 μmol 引物各 1μL,終體積為 50 μL。反應程序95 ℃ 5 min;90 ℃ 30 s;58 ℃ 30 s; 72 ℃ 90 s，反應30個循環，循環結束后 72 ℃ 延伸5 min。 經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測后,回收目的片段與 pMD-19T 克隆載體連接,轉化大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1(全式金，北京)大腸桿菌中,經菌液PCR驗證后選擇陽性克隆載體送華大生物技術公司進行測序。

1.4 長葉紅砂RtCOMT原核表達載體構建

利用帶有BamHⅠ(5′-CGCGGATCCATGACACTGCTGAG-3′)和SalⅠ(5′-ACGCGT-CGACTCAATTCTTCAAAAATTC-3′)酶切位點的引物擴增RtCOMT序列，與pMD19T simple 載體連接，轉化大腸桿菌。經酶切、測序驗證，挑選陽性克隆載體。用BamHⅠ和SalⅠ酶切陽性克隆載體和表達載體pET-32a，產物經12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段。將回收的RtCOMT目的片段分別與原核表達載體線性pET-32a進行連接獲得重組質粒pET32a-RtCOMT，連接產物轉入大腸桿菌細胞中，菌液PCR和雙酶切篩選陽性表達載體后送測序。

1.5 長葉紅砂RtCOMT蛋白誘導表達

重組質粒pET32a-RtCOMT轉化E.coliROSETTA表達菌，挑選陽性單菌落在LB液體培養液中37 °C 、200 r/min過夜培養。新鮮的LB菌液按1∶100的體積比接種到50 mg/L Amp LB液體培養基中進行擴培，當 OD600到達0.6時，加入IPTG,終濃度到達0.8 mmol/L，在28 ℃恒溫搖床，200 r/min下繼續培養4 h進行外源蛋白誘導表達。誘導前后各取1 mL菌液，12 000 r/min離心1min，棄上清。用2×SDS上樣緩沖液重懸菌體后100 ℃煮沸5 min，用質量分數為12%的SDS-PAGE 膠電泳檢測結果。

1.6 長葉紅砂RtCOMT蛋白純化

選取陽性表達菌株經IPTG誘導RtCOMT蛋白表達，離心收集菌體。用Binding buffer(上海生工生物工程技術服務有限公司)重懸菌液，將重懸液用液氮反復凍融3次后加入溶菌酶(1 g/L)，冰浴30 min。200～300 W超聲波超聲3 s,間歇5 s,重復2～3次，4 ℃、15 000 r/min，離心20 min收集上清。用2 mL Binding-buffer預洗Ni-IDA His-Bind Resin吸附柱(上海生工生物工程技術服務有限公司)然后將收集的上清液移入吸附柱中，流速0.5～1 mL/min進行柱層析。然后用Bind-buffer洗脫吸附柱3～5次，直到洗脫液OD280到達最初水平，然后用Elution-buffer洗脫吸附柱，收集洗脫液，12%的SDS-PAGE 膠電泳檢測結果。

1.7 生物信息學分析

用NCBI-ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)找出RtCOMT基因開放閱讀框，Primer primer 5設計引物。用clustalx軟件和Mega 5.0軟件比較長葉紅砂與其他植物COMT蛋白質同源性，構建系統進化樹。用ProtParam( http://web.expasy.org/protparam/)程序分析RtCOMT理化性質，用ExPASy中的SOPMA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Web-based SWISS-MODEL server(http://www.swissmodel.expasy.org)分析RtCOMT蛋白結構。

2 結果與分析

2.1 長葉紅砂RtCOMT基因克隆

從長葉紅砂轉錄組數據庫中發現功能注釋為COMT蛋白的基因序列(unigene22419)，其長度為1 380 bp，通過ORF-Finder軟件預測其開放閱讀框，利用RT-PCR技術克隆獲得長葉紅砂RtCOMT基因編碼區序列，該序列長1 023 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，編碼340個氨基酸。將RtCOMT與其他物種COMT蛋白進行系統進化樹分析發現，RtCOMT和野茶樹(ADN27527.1)、丹參、(AEO14870.1)、木本棉(KHG13754.1)、鷹嘴豆(XP004502769.1)、毛白楊(AFZ78575.1)和梅花(XP008234634.1)等植物COMTs序列有58%～65%同源性，其中，與野茶樹同源性最高為65%(圖1)。

圖1 RtCOMT和其他植物COMT系統樹進化分析

2.2 長葉紅砂RtCOMT蛋白質理化性質及結構分析

經RtCOMT蛋白理化性質分析，推測其蛋白分子質量37.24 ku，理論等電點6.71。蛋白質二級結構分析顯示,RtCOMT蛋白中有16 處α-螺旋,占序列全長的43.36%;有15 處β-轉角,占序列全長的10.03%;27處無規則卷曲,占序列全長的28.32% ，另外還有18.29%的延伸結構(圖2-A)。氨基酸序列比對發現RtCOMT的181-277氨基酸屬于依賴S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶結構域(sadenosyllmethionine-dependent methy-trans-ferases，SAM)，與其他植物COMT蛋白序列一致，RtCOMT蛋白包含COMT保守殘基LVDVGGGTGA。與紫花苜蓿蛋白結構比對，推測RtCOMT催化殘基為H246D274E305(圖2-B)。

圖2 長葉紅砂RtCOMT蛋白序列及結構分析

2.3 長葉紅砂RtCOMT基因原核表達載體的構建

RtCOMT基因陽性克隆載體經雙酶切，得到與RtCOMT基因的開放閱讀框核苷酸數相符，含有粘性末端的目的條帶，將其與表達載體pET32a連接，構建原核表達載體pET32a-RtCOMT。將重組表達載體pET32a-RtCOMT轉化E.coli感受態細胞中培養，挑選單克隆菌落，進行PCR 陽性單克隆鑒定，結果都擴增出約1 000 bp的基因片段，與預測大小相符。然后對陽性菌落進一步雙酶切鑒定，結果發現載體pET32a-RtCOMT酶切后都產生2條片段，一條與目的基因大小相符，另外一條和載體大小相符(圖3)。

2.4 長葉紅砂RtCOMT蛋白誘導表達及純化

將原核表達重組載體pET32a-RtCOMT導入E.coli表達菌中Rossetta(DE3)中，命名為pET32a-RtCOMT/Rosetta。經IPTG誘導處理，在分子質量約60 ku處檢測到帶有His標簽的RtCOMT融合表達蛋白，除去23 ku的融合蛋白標簽，其大小與理論值相符(圖4，泳道2)。融合蛋白帶有6×His標簽，可與吸附柱中鎳離子相互作用而結合到親和介質上。本研究將裂解的上清菌液加樣到Ni-IDA吸附柱中，蛋白充分結合到介質上，先用洗滌緩沖液洗滌雜蛋白(圖4，泳道3和4)，再用洗脫緩沖液將RtCOMT重組蛋白洗脫下來獲得一條清晰的目的蛋白條帶，與IPTG誘導后RtCOMT表達重組蛋白的條帶大小一致(圖4，泳道6和7)。

圖3 陽性重組質粒的菌落PCR和雙酶切鑒定

圖4 SDS-PAGE 分析RtCOMT在大腸桿菌中過表達及純化過程

3 討 論

Joshi等[16]將甲基轉移酶(OMTs，O-Methyltransferases)分為2種，一種低分子質量甲基轉移酶 (23～27 ku), 催化活性依賴Mg2+，并且不能將咖啡酸作為催化底物。而另外一種恰恰相反，分子質量較高(36～43 ku), 催化活性不依賴Mg2+,可以甲基化多種底物包括咖啡酸。COMT屬于后者，是苯丙烷代謝途徑[phenyl propanoid (PP) pathway]中關鍵酶之一，不僅能調控木質素積累，而且能影響黃酮類、酚類和生物堿等化合物合成[17]。因此，在植物生長發育過程中，COMT對其木質化程度、組織顏色和果實成熟等生理活動都有影響。目前已經從多種植物中克隆獲得COMT基因并且對其蛋白結構和催化功能進行深入研究[11]。紫花苜蓿中，已經通過晶體學分析MsCOMT蛋白結構，確定其保守序列、SAM結合位點和催化位點[18]。本研究通過序列分析和蛋白結構預測發現，RtCOMT包含S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶結構域、保守殘基(LVDVGGGTGA)和催化位點等COMT蛋白關鍵結構。

大腸桿菌能高效、低廉且穩定表達外源蛋白，已經有多種植物基因轉入大腸桿菌中正常表達，發揮其生物學功能[19]。研究證明，在煙草(38～43 ku)[8]，苜蓿(41～43 ku)[20]，山楊(40 ku)[21]和甘蔗(39 ku)[22]等植物中COMT是一種可溶性蛋白，能在大腸桿菌中功能表達。本研究證明長葉紅砂COMT基因也可在大腸桿菌中正常表達，生成約37 ku的可溶性蛋白，與其他植物COMT蛋白大小相似。目前通過純化模式植物和農作物中COMT蛋白，體外獲得目的蛋白，對其蛋白晶體結構和催化能力有了深入了解[8, 18]。本研究采用pET32a(+)表達載體進行原核表達,得到的體外重組蛋白RtCOMT是帶有6個His-Tag的融合蛋白。His-Tag序列的組氨酸與固定化金屬離子(通常為Ni2+或Cu2+)具有親和力，且不影響目的蛋白的天然結構和活性。因此，用Ni-IDA His-Bind方法對RtCOMT重組蛋白進行純化,獲得RtCOMT蛋白可直接用于功能檢測，為深入探索RtCOMT蛋白功能奠定基礎。

4 結 論

本研究從長葉紅砂中克隆得到RtCOMT基因的編碼區序列長1 023 bp，編碼340個氨基酸，推測蛋白分子質量37.24 ku，理論等電點為 6.71。構建RtCOMT原核表達載pET32a-RtCOMT，并將其轉化大腸桿菌。重組菌經IPTG誘導和SDS-PAGE電泳檢測，觀察到60 ku融合蛋白表達，與預期蛋白大小一致。采用Ni-IDA His-Bind親和層析方法對RtCOMT重組蛋白進行純化,體外獲得目的蛋白。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Cloning and Purification of Caffeic Acid O-methyltransferase (RtCOMT) fromReaumuriatrigyna

ZHANG Huirong, FENG Jie, ZHAO Pingping and WANG Yingchun

(College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Reaumuriatrigynais a small shrub grown in the Eastern Alxa-Western Ordos area of Inner Mongolia.R.trigynahas a vital ecological function for its remarkable tolerance to salt and drought. Additionally,R.trigynais a traditional herb to cure eczema, dermatitis and other diseases. Caffeic acid O-methyltransferase (COMT) is an important methyltransferases which involved in synthesis of S-lignin, and plays significant roles in various physiological processes in plant life cycle. We isolated an open reading frame (ORF) ofRtCOMT, constructed expression vectors ofRtCOMTand transformed it intoE.colilines. The ORF ofRtCOMTwas 1 023 bp which encodes a protein with 340 amino acids and characterized predicted isoelectric point (pI) 6.71 and molecular mass 37.24 ku. The overexpression and purification recombinant protein were extracted and analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the result showed that size of the recombinant protein was consistent with the predicted . The His-tagged recombinant proteins of RtCOMT were purified by Ni-IDA His-Bind to obtainRtCOMTin vitro, it is necessary for further study in protein structure and catalytic function ofRtCOMT.

Reaumuriatrigyna; Caffeic acid O-methyltransferase (COMT); Prokaryotic expression; Protein purification

ZHANG Huirong,female,Ph.D student.Research area:plant resistance and molecular biology, functional components.E-mail: 523537961@qq.com

WANG Yingchun, female,professor.Research area:plant resistance and molecular biology, functional components.E-mail: ycwang@imu.edu.cn

日期：2016-10-20

2015-06-10

2015-08-31

國家自然科學基金(31360063)；內蒙古自治區高等學校創新團隊發展計劃(NMGIRT1401)。

張慧榮，女，在讀博士，從事植物分子與抗逆生物學。E-mail：523537961@qq.com

王迎春，女，教授，從事植物分析與抗逆生物學。E-mail: ycwang@imu.edu.cn

Q943.2

A

1004-1389(2016)10-1529-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.032.html

Received 2015-06-10 Returned 2015-08-31

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31360063); Program for Innovative Research Team in Universities of Inner Mongolia Autonomous Region(No.NMGIRT1401).