高效液相色譜法測定白蘭地中的多酚類物質

吳帥，王錕，由菊，楊潔

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺264000；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；3.煙臺市質量認證咨詢中心，山東煙臺264000；4.青島市食品藥品檢驗研究院，山東青島266000）

高效液相色譜法測定白蘭地中的多酚類物質

吳帥1，2，王錕3，由菊3，楊潔4

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺264000；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；3.煙臺市質量認證咨詢中心，山東煙臺264000；4.青島市食品藥品檢驗研究院，山東青島266000）

將白蘭地經0.45μm濾膜過濾后直接進樣，選用InertsilODS3C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以添加1%甲酸的乙腈、甲醇和水為流動相，采用梯度洗脫方式，對多酚物質進行分離。選取二極管陣列檢測器，對待測物進行定性及定量分析。試驗結果表明，在一定范圍內，標準物質呈現良好的線性關系，檢出限能夠滿足定量要求。利用上述方法對30個白蘭地樣品進行分析，結果表明，所有樣品中均檢出沒食子酸、鞣花酸和糠醛；大部分樣品中檢出香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、芥子醛和松柏醛；選取的樣品中未檢出原兒茶酸、芥子酸、阿魏酸和肉桂酸。

高效液相色譜；白蘭地；多酚

白蘭地是一種蒸餾酒，以水果為原料，經過發酵、蒸餾、貯藏、陳釀而成。以葡萄為原料的蒸餾酒叫葡萄白蘭地[1]。通常講的白蘭地，都是指葡萄白蘭地。白蘭地色澤金黃晶亮，具有幽雅細膩的葡萄果香和濃郁的陳釀橡木香，口味甘冽，在世界范圍內廣受消費者歡迎。多酚類物質是一類具有大而復雜結構的化合物，從本質上講酚是芳香環上聯有一個或多個羥基的化合物，含有酚官能團。多酚類物質是葡萄中重要的次生代謝產物，對所釀葡萄酒的特征和品質非常重要。同時，多酚類物質也是白蘭地的重要特征成分，對酒的感官起著重要作用，是評價白蘭地品質的重要評價指標之一[2]。因此，準確地定量分析白蘭地中多酚化合物的種類和含量，對控制白蘭地的品質具有重要意義。目前，酒中多酚類物質的分析方法主要有高效液相色譜二極管陣列法[3]、高效液相色譜電化學分析法[4]、毛細管電泳電化學檢測法[5]和高效液相色譜-質譜聯用法[6]等。本文采用反相高效液相色譜二極管陣列檢測法測定白蘭地中的多酚類物質。采用該檢測方法，能

夠簡便快速地對白蘭地中的多酚化合物進行定性及定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

白蘭地：來源于生產企業或當地超市。

1.2 主要設備和試劑

1.2.1 主要設備

WATERS2695液相色譜儀（配有2996二極管陣列檢測器）：美國waters公司。

1.2.2 主要試劑

甲醇和乙腈為色譜純；甲酸為分析純。

標準品為沒食子酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、原兒茶酸、丁香醛：購自美國Fluka公司；糠醛、松柏醛、芥子醛、阿魏酸、芥子酸：購自美國Sigma-Aldrich公司；鞣花酸：購自美國Alfa Aesar公司；香草醛：購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 標準溶液的配制

分別精確稱取沒食子酸、糠醛、原兒茶酸、香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、阿魏酸、芥子酸、松柏醛、芥子醛、鞣花酸、肉桂酸各50mg（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容，配成1 000mg/L的標準品儲備液，于4℃下避光保存，備用。用50%（體積比）甲醇水溶液配制質量濃度均為0.2、1、2、5、10、50、100mg/L的系列混合標準工作曲線。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：InertsilODS3（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：1%甲酸-甲醇溶液（A），1%甲酸-乙腈溶液（B），1%甲酸-水溶液（C），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradientelution p rocedure

流量：1.0mL/min。進樣量：5μL；柱溫：30℃；檢測波長：275 nm，320 nm。

1.4.2 樣品前處理

白蘭地樣品經0.45μm微孔濾膜過濾，在儀器工作條件下進行分析。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據待分離物的特點，選擇C18色譜柱為試驗用色譜柱。分別考察了waters symmetry C18（4.6mm× 150mm，5μm）、依利特Sinochrom ODS-BP（4.6mm× 200mm，5μm）、迪馬InertsilODS-3（4.6mm×250mm，5μm）對待測物的分離效果。結果顯示，選擇150mm或200mm色譜柱時，分離效果較差。為了更好地對目標物進行分離，試驗選擇250mm色譜柱，利用長柱吸附強的特點，使保留相近的化合物得以分開。

2.2 流動相的選擇

本文考察了乙腈、甲醇和水作為流動相的洗脫效果。單獨采用乙腈或甲醇作為流動相時，分析物分離度較差，且峰形拖尾嚴重。這可能是由于酚羥基易產生電離，在固定相表面有雙重的保留機制。為了改善這種現象，在流動相中添加1%（體積比）甲酸，峰形得到有效改善。此外，為了使分析物得到有效分離，同時采用乙腈和甲醇作為有機相進行洗脫。通過試驗可知，分別在乙腈、甲醇和水中添加1%的甲酸時，酚酸、酚醛物質能夠達到顯著的分離效果且峰形對稱。在試驗中發現，采用等度洗脫，阿魏酸和芥子酸、松柏醛和芥子醛等多種組分在短時間內難以較好地分離，故采用梯度洗脫方式，洗脫程序如1.4.1所述。

2.3 最佳吸收波長的選擇

在色譜條件下對混合標準品進行測定，各化合物保留時間和測定波長見表2。

表2 混合標準品的保留時間和檢測波長Table2 The retention tim eand detection wavelength of the standards

通過比較13種標準品的光譜圖可知，對羥基苯甲酸衍生物在260 nm～280 nm有較大吸收，而酚醛類在320 nm附近處有較大吸收。為了提高待測物的響應信號，本試驗同時選擇275 nm和320 nm兩個波長進行定量，不同波長下的標準品色譜圖見圖1。

圖1 多酚類物質標準品色譜圖Fig.1 The chrom atogram of polyphenols

2.4 方法的線性關系和檢出限

混合標準溶液濃度范圍為0.2、1、2、5、10、50、100mg/L，按照試驗方法進行測定。以定量波長下的色譜峰面積Y對質量濃度X做線性回歸方程，相關系數及檢出限見表3。

表3 線性回歸方程、相關系數和檢出限Table3 Linear regression equation，correlation coefficientand detection lim it

續表3 線性回歸方程、相關系數和檢出限Continue table3 Linear regression equation，correlation coefficientand detection lim it

由表可知，在給定的色譜條件下，標準物質線性范圍較寬，相關系數較高，檢出限低，適用于分析白蘭地中的多酚化合物。

2.5 回收試驗

在已知含量的白蘭地樣品中加標，按照儀器條件進行測定，計算平均添加回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表4。

表4 回收試驗結果（n=6）Table4 The resultsof recovery（n=6）

由表可知，回收率在88.3%～108.3%之間，且相對標準偏差在2.8%以內。

2.6 樣品分析

分別對XO、VSOP、VO、VS等不同類型的30種白蘭地樣品進行測定，測定結果見表5。

表5 白蘭地多酚物質的測定結果分析Table5 Detection resultof polyphenols in brandy

從表可以看出，所有樣品中均檢出沒食子酸、鞣花酸和糠醛；大部分樣品中檢出香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、芥子醛和松柏醛；選取的30個樣品中未檢出原兒茶酸、芥子酸、阿魏酸和肉桂酸。圖2為某白蘭地樣品（XO）的色譜圖，該樣品檢出9種多酚物質。白蘭地需要在橡木桶中經過多年的儲存陳釀才能達到成熟，在此期間，木桶中的多酚物質不斷被吸收，多酚物質的含量呈現遞增趨勢[7]，酒質也趨于完善。試驗中檢出的沒食子酸、鞣花酸、香草醛、丁香醛和糠醛等均與橡木桶自身組分密切相關。

圖2 白蘭地樣品色譜圖Fig.2 The Chrom atogram of Brandy

3 結論

本文建立了白蘭地中多酚類物質的高效液相色譜分析方法。試驗結果表明，采用樣品微膜過濾后直接進樣的方式，可以節省前處理時間。該方法選用合適的流動相及檢測波長，能夠有效地降低干擾，合理地將待測物分離，適用于生產中白蘭地品質的監控。

[1]王恭堂.白蘭地工藝學[M].北京:中國輕工業出版社,2002

[2]曾玩嫻.質量評價指標在打擊白蘭地假冒偽劣中的應用[J].釀酒科技,2012(5):74-76

[3]陳建業,溫鵬飛,戰吉成,等.葡萄酒中11種酚酸的反相高效液相色譜測定方法研究[J].中國食品學報,2006,6(6):133-138

[4]曹煒,索志榮,宋紀蓉,等.葡萄酒中7種酚酸的色譜電化學分析[J].高等學校化學學報,2005,26(8):1424-1427

[5]曹玉華,張欣,方禹之,等.毛細管電泳電化學檢測法測定紅葡萄酒中的多元酚[J].高等學校化學學報,2001,22(12):2011-2013

[6]孫建平,侯小歌,梁峰,等.高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法測定紅葡萄酒中酚類物質[J].分析化學,2006,34(11):1565-1569

[7]張斌,曾新安,楊華峰,等.電場對橡木桶陳釀白蘭地中多酚類物質的影響[J].華南理工大學學報(自然科學版),2012,40(5):145-148,154

Determ ination of Polyphenols in Brandy by High Performance Liquid Chromatography

WUShuai1，2，WANGKun3，YOU Ju3，YANG Jie4
（1.YantaiTesting Center for Food and Drug，Yantai264000，Shandong，China；2.Collegeof Food Science and Engineering，Shandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，Shandong，China；3.YantaiQuality Certification Consulting Center，Yantai264000，Shandong，China；4.Qingdao Institute for Food and Drug Control，Qingdao266000，Shandong，China）

Thebrandyafter0.45μmmembrane filterwasdetermined using inertsilODS3C18 column（4.6mm× 250mm，5μm）.The polyphenol compoundswere isolated using themobile phase adding 1%formic acid in acetonitrile，methanol and water with gradient elution mode.The results showed that in a certain range，the standard material presented a good linear relationship and the detection limitwas suitable for the quantitative requirements.Thirty brandy sampleswere determined by the abovemethod.The resultsshowed thatall samples were detected outgallic acid，ellagic acid and furfural.Themajority of the sampleswere detected out vanillic acid，syringic acid，vanillin，syringaldehyde，sinapaldehyde and coniferaldehyde.The compoundsof protocatechuic acid，sinapic acid，ferulic acid and cinnamic acidwerenotdetected in thebrandy samples.

high performance liquid chromatography（HPLC）；brandy；polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.037

2015-09-18

吳帥（1979—），女（漢），高級工程師，博士研究生，研究方向：發酵工程、食品檢測。