福林酚比色法測定酸漿宿萼中總多酚含量

張洋婷，郗艷麗，葛紅娟，馮小雨，馬洪波

（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

福林酚比色法測定酸漿宿萼中總多酚含量

張洋婷，郗艷麗，葛紅娟，馮小雨，馬洪波*

（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

優化福林酚法測定酸漿宿萼總多酚含量的條件，并對其進行分析評價。結果表明：樣本0.5mL，福林酚用量1.0mL，10%Na2CO3用量8mL，當反應時間為2.5 h，反應溫度為20℃，在波長760 nm處測定時，總多酚的含量與吸光度呈良好的線性關系，該方法操作簡便、靈敏度高、精密度高，穩定性好，適宜酸漿宿萼總多酚含量的測定。

酸漿宿萼；福林酚；多酚

酸漿 （Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast）Makino）是茄科酸漿屬，多年生宿根草本植物，又名紅姑娘、掛金燈等[1]。成熟時紅似瑪瑙，外觀美麗，酸甜可口，全身可入藥[2]。酸漿宿萼為藥典中明確規定的藥用部位，其味酸、苦，性寒，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用[3]。在我國部分地區，有將酸漿宿萼曬干后當茶飲的習俗，可清熱去火。植物多酚是一類具有獨特生理活性和藥理活性的天然產物，廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉和咖啡等植物體內[4-5]。大量研究表明，植物多酚在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎殺菌、保護心血管等很多方面具有顯著的作用[6-11]，因而，在制藥、生化、日化、食品以及精細化工等領域具有廣泛的應用前景[12]。

多酚類物質含量的測定方法較多，例如高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵比色法、福林酚比色法、紫外分光光度法、原子吸收法和高效液相色譜法等[13-17]，相比較而言，福林酚法操作簡單，重現性好，是目前測多酚的通用方法。但福林酚法目前尚未有統一的實驗條件，文獻報道各種植物提取物的測定條件，例如福林酚用量，碳酸鈉的濃度和用量、反應體系體積、反應時間及溫度等都不盡相同。因此，本試驗旨在優化福林酚法測定酸漿宿萼總多酚含量的條件，建立一種便捷、準確的測定方法，為進一步研究酸漿宿萼總多酚生物活性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿宿萼：采購于吉林省吉林市豐滿區，經自然風干后，粉碎，置于干燥器中，備用。

碳酸鈉、無水乙醇、沒食子酸、福林酚：均為分析純，市購。

1.2 儀器與設備

AF-20A型高速粉碎機：溫嶺市奧力中藥機械有限公司；FA1104N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；KQ-100DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司；722可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 條件的優化

1.3.1.1 測定波長的確定

分別移取樣品液和沒食子酸標準溶液各0.5mL于具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入1.0mL福林酚試劑，靜置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至25mL，室溫下避光反應2.5 h，在500 nm～900 nm波長范圍內測定吸光值，從而選擇最佳測定波長。

1.3.1.2 10%Na2CO3溶液用量的確定

精密移取5份0.5mL樣品液于25mL具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入福林酚顯色劑1.0mL，靜置1min后分別加入10%Na2CO3溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，蒸餾水定容至25mL，室溫下避光反應2.5 h后，在最佳波長處測定吸光值，以確定10% Na2CO3溶液的用量。

1.3.1.3 福林酚用量的確定

取6份0.5mL樣品液于25mL具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入福林酚顯色劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，靜置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至25mL，室溫下避光反應2.5 h后，在最佳波長處測定吸光度，以確定福林酚的用量。

1.3.1.4 顯色溫度的確定

取5份0.5mL樣品液于25mL具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入福林酚試劑1.0mL混勻，靜置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至25mL，分別在15、20、25、30、35℃條件下水浴避光反應2.5 h，在最佳測量波長處進行吸光度，以確定適宜的反應溫度。

1.3.1.5 顯色時間的確定

取6份0.5mL樣品液于25mL具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入福林酚顯色1.0 mL，靜置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度，在最佳溫度下避光反應1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后，在最佳測量波長處進行吸光度，以確定適宜的反應時間。

1.3.2 樣品中總多酚含量的測定

分別移取沒食子酸標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2mL，置于25mL具塞試管中，加入5mL蒸餾水，混勻后加入1.0mL福林酚顯色劑，靜置1min后加入10%Na2CO3溶液8mL，加蒸餾水定容至刻度，20℃下避光反應2.5 h后，在760 nm處測定吸光度，以沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取待測樣品0.5mL于具塞試管中，其他操作同上，根據標準曲線計算出樣品中總多酚的含量。

1.3.3 分析方法的評價

1.3.3.1 精密度試驗

取5份0.5mL樣品于具塞試管中，按優化后的條件測定吸光度。計算相對標準偏差，評價分析方法的精密度。

1.3.3.2 穩定性試驗

取0.5mL樣品于具塞試管中，按優化后的條件進行操作，于20℃條件下避光分別放置0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 h后在760 nm處測定吸光度。計算相對標準偏差，評價分析方法的穩定性。

1.3.3.3 加標回收試驗

取5份0.5mL樣品于具塞試管中，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL沒食子酸標準溶液，按優化的條件測定吸光度。計算沒食子酸的平均回收率和試驗結果的相對標準偏差，評價試驗方法的可靠性。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 最佳測定波長的確定

研究表明福林酚試劑與多酚物質的反應在680 nm～780 nm處有較大吸收。取樣品適量，經過溶劑提取后，得到供試原液。常溫避光反應2.5 h后，以蒸餾水為空白，500 nm～900 nm可見光區下掃描，樣品和沒食子酸標準溶液的光譜吸收曲線見圖1。

圖1 樣品（a）和沒食子酸標準溶液（b）的光譜吸收曲線Fig.1 Spectralabsorption curveof sample（a）and standard gallic acid solution（b）

從圖1可以看出兩者均在760 nm有最大吸收，故選760 nm為檢測波長。

2.1.2 10%Na2CO3溶液用量的確定

碳酸鈉溶液是福林酚法測定多酚反應的緩沖液，碳酸鈉對顯色效果的影響見圖2。

圖2 10%Na2CO3用量對反應的影響Fig.2 Effectsof volum esof 10%Na2CO3on absorbance

從圖2可知，吸光度值隨著10%Na2CO3用量的增加而增大，當10%Na2CO3溶液用量為8mL時，吸光度值達到最大；此時，繼續增加10%Na2CO3用量，吸光度值則減少，所以10%Na2CO3溶液的最佳用量為8mL。

2.1.3 福林酚用量的確定

福林酚試劑與多酚物質結合在堿性條件下呈藍色，福林酚試劑對反應顯色效果的影響如圖3所示。

圖3 福林酚用量對反應的影響Fig.3 Effectsof volum esof Folin Ciocalten reagenton absorbance

由圖3可以看出，福林酚試劑用量小于1.0mL時，吸光值增加明顯，福林酚試劑大于1.0mL時，吸光值增加不明顯，趨于穩定。因此，選擇選擇福林酚試劑加入量為1.0mL。

2.1.4 顯色溫度的確定

溫度會影響多酚物質的穩定性。在相同的反應條件下，溫度對顯色效果的影響見圖4。

由圖4可知，反應溫度在15℃～20℃范圍內時，吸光度值隨著溫度的增加而降低；當顯色溫度大于20℃時，吸光值則隨著溫度的增加而降低。所以，最佳反應溫度確定為20℃。

圖4 顯色溫度對反應的影響Fig.4 Effectof tem peratureon absorbance

2.1.5 顯色時間的確定

顯色時間不足會影響測量結果的準確性，顯色時間對顯色效果的影響如圖5所示。

圖5 顯色時間對反應的影響Fig.5 Effectof reaction timeon absorbance

由圖5可知，當顯色時間在1.0 h～2.5 h內時，吸光度值隨著顯色時間的增加且逐漸增大，2.5 h對應的吸光度值最大；當顯色時間大于2.5 h時，吸光度值的變化幅度不大，基本持平。考慮到時間過長不利于試驗操作，因此，確定反應時間為2.5 h。

2.2 樣品中總多酚含量的測定

以沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。回歸方程為y=0.116x-0.028 5，相關系數R2=0.998 9。取0.5mL待測樣品，按照上述方法測定其的吸光度為0.059，計算出酸漿宿萼提取物總多酚含量為9.495mg/g。

2.3 分析方法評價

2.3.1 精密度試驗

將同一份樣品反應液連續測定6次吸光度值，相對標準偏差RSD為0.82%，說明該儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

按照已確定的反應條件制備5份平行樣品溶液，分別測定其吸光度值，相對標準偏差（RSD）為2.78%，

說明該方法重現性良好。

2.3.3 加標回收試驗

加標回收試驗結果見表1。

表1 加標回收試驗結果Table1 Resultof average recovery experim ent

從表1可以看出各組的回收率在95.3%～104.9%，平均回收率100.1%，相對標準偏差（RSD）為3.89%，說明該分析方法可靠，可用于酸漿宿萼多酚含量的測定。

3 結論

在參考GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[18]的基礎上，對福林酚法測定酸漿宿萼總多酚含量的條件進行探索。得出福林酚比色法測定酸漿宿萼的適宜條件為：10%Na2CO3溶液用量8mL，福林酚試劑用量為1.0mL，20℃避光反應2.5 h，在760 nm處檢測酸漿宿萼中多酚類物質的吸光度值。并且該方法的平均回收率為100.1%，相對標準偏差為3.89%，可用于酸漿宿萼中總多酚含量的測定。

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Determ ination of Total Polyphenols in Calyx Physalis by Folin-ciocalteu M ethod

ZHANGYang-ting，XIYan-li，GEHong-juan，FENGXiao-yu，MA Hong-bo*
（SchoolofPublic Health，Jilin MedicalUniversity，Jilin 132013，Jilin，China）

Theoptimum condition on determining totalpolyphenols content in calyx physalisby Folin-ciocalteu method was studied.The results indicated that the optimum conditions for total polyphenols determination by Folin-Ciocalteu were as follows：1.0mL of Folin-ciocalteu reagentwas added in 0.5mL of sample，and then 8mL of10%sodium carbonate solution wasadded.After the coloration reactionwas for2.5 h at20℃，the opticaldensitywasmeasured at760 nm.Under theoptimum conditions，theabsorbance increased linearlywith the concentration of gallic acid.Themethod is fast，highly precise and stable，and suitable for determining total polyphenol contentin calyx physalis.

calyx physalis；Folin-ciocalteu；polyphenol

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.032

2016-09-13

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（2013360）；吉林省衛生計生課題（2014ZC063）；吉林省教育廳項目（2015403）

張洋婷（1986—），女（漢），助教，碩士，研究方向：營養與食品衛生。

*通信作者：馬洪波（1969—），男（漢），副教授，碩士。