MicroRNA-199a/b-3p抑制三陰乳腺癌細胞增殖機制研究①

王子航 王志成 張嘉星 范運達 康勁松 米旭光

(吉林大學臨床醫學院，長春130021)

?

MicroRNA-199a/b-3p抑制三陰乳腺癌細胞增殖機制研究①

王子航②王志成 張嘉星 范運達 康勁松③米旭光④

(吉林大學臨床醫學院，長春130021)

目的：探討microRNA-199a/b-3p(miR199)抑制三陰乳腺癌細胞增殖存活的作用機制。方法：在三陰乳腺癌細胞BT549、MDA-MB-231轉染miR199，熒光定量檢測miR199表達量；MTT法檢測轉染miR199對三陰乳腺癌細胞存活率的影響；細胞周期分析檢測，轉染miR199對在乳腺癌細胞細胞周期的影響。結果：超表達miR199后，三陰乳腺癌細胞BT549、MDA-MB-231的增殖率分別下降(41.02±2.34)%和(28.42±6.70)%，細胞周期均被阻滯在G1期。結論：miR-199a/b-3p抑制三陰乳腺癌增殖，具有抗三陰乳腺癌增殖藥物開發的潛質。

三陰乳腺癌；microRNA-199a/b-3p；增殖

自1991～2010年間，乳腺癌死亡率增長了32.89%，成為死亡率增長最快的癌癥，其發病率位居大城市女性腫瘤的第一位[1]。近年來，我國乳腺癌發病率的增長速度已高出原高發國家1～2個百分點，且呈明顯的年輕化趨勢，每年有16.9萬婦女患乳腺癌[2]。根據乳腺癌分子分型，三陰乳腺癌為雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER2)均為陰性表達的乳腺惡性腫瘤，約占所有乳腺癌病理類型的10%～17%[3]，相對非三陰乳腺癌，三陰性乳腺癌無分子治療靶點，內分泌治療無效；惡性度高，應用化療藥物治療則敏感率低、副作用大，且預后差，易復發和轉移[4]。因此需找新的治療靶點和手段是三陰乳腺癌研究中的熱點，本研究擬通過外源轉入microRNA-199a/b-3p對三陰性乳腺癌增殖進行抑制，以達到抗癌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養相關材料 三陰乳腺癌BT549、MDA-MB-231細胞，使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中國)的DMEM培養基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml，37℃ 5%CO2條件下培養，細胞生長至對數期時傳代。

1.1.2 主要實驗試劑耗材 microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中國)、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，中國)、Lipofecta-mineTM2000(Life Technologies公司，美國)、MTT(Sigma-Aldrich公司，美國)、SYBR GREEN Master mix(Roche，瑞典)、其他常規試劑(北京化工，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的轉染(脂質體法) 在轉染前24 h，1×106/孔在6孔細胞培養板中接種細胞。轉染前將細胞培養液換成不含抗生素不含血清的不完全培養液。將待轉染miRNA mimics按說明書加入到250 μl雙無培養液中，吹打混勻。同時，將5～10 μl脂質體加入到250 μl雙無培養液中，吹打混勻。室溫靜置5 min后，將兩者混勻。室溫孵育20 min后，將混合液加入到待轉孔中并混勻。培養5 h后，將細胞培養液換成完全培養液。

1.2.2 熒光定量分析 以Trizol法提取細胞RNA，逆轉錄成cDNA，以SYBR熒光染料定量檢測miR-199表達量。根據試劑說明書添加各組分后，95℃預變性30 s，然后40循環的擴增反應(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同時融解曲線分析。結果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數比值。

1.2.3 細胞增殖分析 將處于生長對數期的細胞消化成單細胞懸液，以0.5～1×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養板中。過夜培養后，更換新鮮培養基，每孔100 μl。按轉染方法向細胞中加入脂質體-待轉染物混合物，每組設三個復孔，同時設對照組，5 h后更換培養基。培養48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養4 h后，移除培養液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標儀中檢測波長570nm處的光吸收值。代入下述公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(實驗組吸光值-空白孔吸光值)/(對照組吸光值-空白孔吸光值)×100%。實驗獨立重復三次后，將各轉染組的細胞存活率導入SPSS軟件，計算P值。

1.2.4 細胞周期分析 將PBS清洗過的待測細胞收集到15 ml尖底離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液后用70%乙醇重懸細胞，4℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，移除固定液，加入PI染液，重懸細胞。室溫避光30 min后用流式細胞儀進行細胞周期分析。

2 結果

2.1 三陰乳腺癌細胞中miR-199a/b-3p表達量分析 在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中，miR-199mimcs轉染組的miR-199表達量分別是對照組的(22.33±0.86)倍和(24.43±0.91)倍，均顯著高于對照組(P<0.01，圖1)。

2.2miR-199抑制三陰乳腺癌細胞增殖miR-199mimcs轉染24h后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞的增殖率分別下降(41.02±2.34)%(圖2A)和(28.42±6.70)%(圖2B)，均顯著低于對照組(P<0.01)。

2.3miR-199誘導三陰乳腺癌細胞G1期阻滯 應用流式細胞術細胞周期分析檢測miR-199抑制三陰乳腺癌細胞增殖的機制。三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中miR-199轉染組G0/G1期細胞所占比例為(75.10±3.09)%和(68.61±3.07)%，與對照組(50.58±1.15)%和(46.39±2.81)%相比均顯著上升(P<0.05)(圖3)，說明轉染miR-199可以將三陰乳腺癌細胞阻滯在G1期。

圖1 三陰乳腺癌細胞中miR-199表達量分析Fig.1 Expression of miR-199 in TNBC cellsNote: *.P<0.01.

圖2 miR-199抑制BT549(A)和MDA-MB-231(B)增殖Fig.2 Proliferation of BT549 and MDA-MB-231 (B) inhibited by miR-199Note: *.P<0.01.

圖3 miR-199對BT549(A)和MDA-MB-231(B)細胞周期的影響Fig.3 Cell-cycle(G0/G1,S and G2/M)analysis of BT549 (A)and MDA-MB-231(B) transfected with miR-199Note: *.P<0.05.

3 討論

我國乳腺癌發病率位居大城市女性腫瘤的第一位，死亡率增長迅速，乳腺癌已成為對婦女健康威脅最大的疾病[5]。現在乳腺癌的治療藥物以蒽環類、紫杉類、諾維本和健擇為主導，對于偏晚期乳腺癌新輔助化療、新輔助內分泌治療將成為常規治療方法進入臨床[6]。依據乳腺癌基因表達特征，將乳腺癌分為5個亞型：包括導管A型(LuminalA型)，導管B型(LuminalB型)，HER-2過表達型(HER-2+型)，基底細胞樣型(Basal-like型)和正常型(Normal-like型)五型[7]。三陰乳腺癌(TNBC)指的是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER-2)表達均為陰性的乳腺癌，約占全部乳腺癌類型的10%～17%[8]。內分泌治療及針對HER-2的分子靶向治療對于三陰乳腺癌無效，目前治療中的主要手段為化療，但預后較差[9]。MicroRNA(miRNA)非編碼單鏈的小分子RNA，具有轉錄后調節功能，其異常表達與多種腫瘤的發生發展密切相關[10]。因此，miRNA在腫瘤診斷、腫瘤分型、預后判斷及基因治療中的作用越來越受到關注。

在多種腫瘤細胞中，MiR-199a/b-3p呈現低表達，恢復miR-199a/b-3p表達可抑制腫瘤細胞的增殖，轉移等[11，12]。因此，本研究擬探究miR-199a/b-3p對三陰乳腺癌增殖的影響及相應機制。在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中超表達miR-199a/b-3p后，細胞的增殖明顯下降，說明miR-199a/b-3p具有抑制三陰乳腺癌細胞增殖的能力，與其在肝癌、骨肉瘤和腎癌細胞中作用相同[11,13]。細胞周期分析發現超表達miR-199a/b-3p后，BT549和MDA-MB-231細胞中G0/G1期細胞所占比例顯著增加，說明miR-199a/b-3p將三陰乳腺癌細胞的細胞周期進程阻滯在G0/G1期，這與其在其他類型腫瘤中的機制相同，相關分子機制可能與miR-199a-3p抑制mTOR、BCAR3、cMET或Brm等蛋白表達相關，但不排除還與抑制其他基因相關。進一步研究miR-199a-3p抑制三陰乳腺癌增殖的分子機制，可為三陰乳腺癌治療新靶點的發現提供較高的理論基礎，并具有一定的臨床價值。

[1] 石曉君，張曉佳，王富生，等.1990-2010年中國女性乳腺癌的死亡分布特征[J].中華疾病控制雜志,2012,16(9):743-747.

[2] 鄭 瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征[J].中國癌癥雜志,2013,23(8):561-569.

[3] 胡 彥.三陰乳腺癌患者預后生存因素臨床分析[J].中外醫療,2015,34(10):67-68.

[4] 曹 靜,呂志排,雷冬梅,等.乳腺癌的分子分型與臨床病理特征及預后的關系[J].診斷學理論與實踐,2013,12(4):466-469.

[5] 令狐銳霞,司 文,李 瑩,等.3846例乳腺癌流行病學及臨床病理學分析[J].解放軍醫學院學報,2015,36(10):1017-1021.

[6] 鐘輝鳳,陳曉品.三陰乳腺癌治療現狀[J].現代醫藥衛生,2015,31(4):488-490.

[7] Lin NU,Vanderplas A,Hughes ME,etal.Clinicopathological features and sites of recurrence according to breast cancer subtype in the National Comprehensive Cancer Network(NCCN)[J].J Clin Oncol,2009,27(15):543-546.

[8] 邱正才.三陰乳腺癌的特征及治療現狀[J].吉林醫學,2015,36(13):2766-2767.

[9] 陳玉娟,王曉東,汪 靜.三陰乳腺癌的特征及治療現狀[J].中國普外基礎與臨床雜志,2012,19(9):113-116.

[10] Yates LA,Norbury CJ,Gilbert RJ.The long and short of microRNA[J].Cell,2013,153(3):516-519.

[11] 陶良俊,秦 超,曹 強,等.MicroRNA-199a-3p在腎癌中的表達及作用[J].現代泌尿生殖腫瘤雜志,2012,4(4):229-232.

[12] 王子航,李春實,康勁松,等.microRNA-199a/b-3p對乳腺癌細胞運動能力的影響[J].中國免疫學雜志,2015,31(9):1242-1244.

[13] Hou J,Lin L,Zhou W,etal.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3Pas therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2011,19(2):7065-7070.

[收稿2015-11-28 修回2016-01-27]

(編輯 張曉舟)

Effect of miR-199a/b-3p on cell proliferation of TNBC cells

WANG Zi-Hang,WANG Zhi-Cheng,ZHANG Jia-Xing,FAN Yun-Da,KANG Jin-Song,MI Xu-Guang.Clinical Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To analyze the inhibiting mechanism of microRNA-199a/b-3p(miR-199)on cell proliferation of triple negative breast cancer(TNBC)cells.Methods: Expression of miR199 in BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199a/b-3p was detected by qRT-PCR.The proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199 were analysed by MTT assay.Cell cycle of TNBC cells transfected with miR-199 was detected by Flow Cytometry assay.Results: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells.Comparing with normal control,the proliferation rate were up to(41.02±2.34)% and(28.42±6.70)%,and the cell cycle were arrest at G1 phase.Conclusion: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of TNBC,and may be a promising anti-cancer drug for TNBC.

TNBC;microRNA-199a/b-3p;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.006

①本文受吉林大學“大學生創新創業訓練計劃”創新訓練國家級培育項目(No. 2015791141)、吉林省科技廳青年基金項目(No.20150520047JH)、吉林省衛生計生科研計劃(No.2014Z013)資助。

王子航(1994年-)，男，臨床醫學專業2012級本科，主要從事抗腫瘤機制的研究，E-mail:1456825616@qq.com。

及指導教師：康勁松(1969年-)，男，博士，副教授，主要從事腫瘤病理生理的研究，E-mail:kangjs@jlu.edu.cn。 米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療研究，E-mail:mixg699@163.com。

R735.7

A

1000-484X(2016)04-0480-03

②延邊大學醫學院，延吉 133002。

③吉林大學基礎醫學院病理生理教研室，長春 130021。

④吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春 130021。