UPLC 同時測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1

朱 穎 史 達(dá)南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院藥品所，江蘇南京 210038

UPLC 同時測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1

朱 穎 史 達(dá)▲
南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院藥品所，江蘇南京 210038

目的 建立同時測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1的UPLC方法。方法 采用UPLC，ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1mm×100mm， 1.7μm），乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速為0.45mL/min，檢測波長為203nm，柱溫為25℃。結(jié)果 人參皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1分別在19.61～392.2μg/mL（r=0.9997）、4.813～96.26μg/mL（r=0.9998）、19.92～398.4μg/mL（r=0.9998）和4.850～97.00μg/mL（r=0.9999）線性關(guān)系良好，平均加樣回收率（n=9）分別為100.00%、99.78%、99.92%和99.83%， RSD分別為0.30%、0.45%、0.29%和0.54%。結(jié)論 方法快速有效，適用于測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1含量。

超高效液相色譜；復(fù)方三七膠囊；人參皂苷

復(fù)方三七膠囊由三七、土鱉蟲、白芷、川芎、當(dāng)歸、乳香（制）、紅花和沒藥（制）八味藥組成，具有化瘀止血、消腫止痛的功效，用于跌打損傷所致的淤血腫痛，具有很好的臨床應(yīng)用價值[1]。目前該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下僅測定方中三七所含的人參皂苷Rg1[1]，其它皂苷類成分的測定國內(nèi)尚未見報道。三七中主要含三七皂苷和人參皂苷類成分，測定三七飲片及其制劑中多種皂苷類成分的報道較多[2-6]。本研究采用UPLC法同時測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及三七皂苷R1的含量，為全面評價該制劑的質(zhì)量提供了有效、可行的方法。

1　一般材料

1.1儀器

ACQUITY UPLC（PDA檢測器，美國Waters），METTLER TOLEDO X205DU分析天平（0.1mg） 。

1.2試藥

復(fù)方三七膠囊（吉林市鹿王制藥股份有限公司，批號：151101），人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110703-201529，含量95.0%），人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110754-201525，含量92.3%），人參皂苷Rb1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110704-201122，含量92.9%），三七皂苷R1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-201318，含量94.0%）。甲醇為色譜純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的配制

分別精密稱取人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品各20mg、人參皂苷Re和三七皂苷R1對照品各10mg，置同一20mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度作為儲備液：人參皂苷Rg1和Rb1濃度1mg/mL，人參皂苷Re和三七皂苷R1濃度0.5mg/mL。

2.2供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物混勻，精密稱取1g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，置水浴上回流2h，放冷，再稱定重量，以甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件

采用ACQUITY UPLC，ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），柱溫35℃，乙腈-水為流動相梯度洗脫（洗脫條件見表1），流速為0.45mL/min ，檢測波長為203nm，柱溫為25℃，進樣量1μL。在此色譜條件下人參皂苷Rg1和人參皂苷Re分離度大于2.0，色譜圖見圖1。

表1　梯度洗脫條件

圖1　復(fù)方三七膠囊UPLC色譜圖

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取對照品儲備液1、1、1、2、3和2mL，分別置100、50、25、25、20和10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣1μL，以峰面積對對照品濃度繪制曲線，分別得回歸方程，結(jié)果見表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5精密度考察

取對照品溶液（三七皂苷R138.80μg/mL、人參皂苷Rg1157.0μg/mL、人參皂苷Re 38.50μg/mL、人參皂苷Rb1159.4μg/mL），進樣1μL，重復(fù)6次，記錄峰面積，計算峰面積RSD%分別為0.09%、0.27%、0.17%和0.08%，精密度良好。

2.6重復(fù)性考察

平行制備6份供試品溶液，分別進樣1μL，記錄主峰面積，計算平均含量分別為三七皂苷R11.152mg/g、人參皂苷Rg13.722mg/g、人參皂苷Re 0.5125mg/g、人參皂苷Rb13.292mg/g，RSD%分別為0.23%、0.35%、0.44%和0.22%，重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察

取供試品溶液一份，分別于0，2，4，8，12，24h時各進樣1μL，記錄主峰面積，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰面積RSD%分別為0.18%、0.22%、0.31%和0.12%，穩(wěn)定性好。

2.8準(zhǔn)確度考察

精密稱取9份已知含量的樣品，每份0.3g，置具塞錐形瓶中，將一定量混合對照品溶液分別加入9份供試品中， 甲醇加入量為50mL減去加入的對照品溶液的體積，照2.2項下方法制備，依法用HPLC測定，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表3（三七皂苷R1）、表4（人參皂苷Rg1）、表5（人參皂苷Re）和表6（人參皂苷Rb1）。結(jié)果表明，本法準(zhǔn)確度較好。

2.9樣品含量測定

精密稱取供試品6份，依2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算含量。平均含量分別為三七皂苷R11.152mg/g、人參皂苷Rg13.722mg/g、人參皂苷Re 0.5125mg/g、人參皂苷Rb13.292 mg/g，RSD%分別為0.23%、0.35%、0.44%和0.22%。

3　討論

3.1色譜條件的確定

人參皂苷類成分的HPLC分析往往需要比較長的時間，如《中國藥典》[6]中三七的皂苷類測定方法需要60min， 文獻(xiàn)報道的一些復(fù)方制劑中測定該類成分也需要60min及更長的時間[8-10]，如要分離人參皂苷Rg1和Re，分析時間則延長更多[5]。UPLC法因分析時間短、分離效率高，越來越多地用于中藥復(fù)雜、難分離成分的測定[7，12]，三七及復(fù)方制劑中人參皂苷類成分的分析時間也因此大大縮短[2-3，11，13-15]，既節(jié)省時間、精力，又大大減少了流動相的使用，降低環(huán)境污染。

表3　三七皂苷R1回收率測定結(jié)果

表4　人參皂苷Rg1 回收率測定結(jié)果

表5　人參皂苷Re 回收率測定結(jié)果

表6　人參皂苷Rb1 回收率測定結(jié)果

復(fù)方三七膠囊中的三七所有藥材均為生藥原粉，有紫外吸收的成分較多，HPLC分離諸多組分較困難。本文采用UPLC法同時測定復(fù)方三七膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及三七皂苷R1，以乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫，檢測波長203nm，通過優(yōu)化梯度洗脫條件，人參皂苷Rg1和Re分離度大于2.0，為全面評價復(fù)方三七膠囊的質(zhì)量提供了快速有效的方法。

3.2提取條件的優(yōu)化

試驗中選擇了甲醇超聲（1h，2h）和甲醇回流（1h，2h，3h，4h）進行提取效率的考察，發(fā)現(xiàn)甲醇回流明顯優(yōu)于甲醇超聲，甲醇回流時間越長測定的四種成分含量越高，回流3h和4h測得含量僅略高于回流2h測得含量，長時間回流意義不大，故選擇甲醇回流2h。甲醇回流提取后，放冷，補足甲醇減失重量后用0.22μm微孔濾膜過濾后即于UPLC進樣分離分析，無過多繁冗的提取步驟，方法精密度、準(zhǔn)確度均較好，簡便易行。

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編（骨傷科分冊）.WS-10619（ZD-0619）-2002.

[2] 陳斌，蔡濤，賈曉斌. UPLC 同時測定蒸制三七中的10 種人參皂苷類活性成分的含量[J].中國中藥雜志，2014，39（9）：1614-1619.

[3] 謝耀軒，林亞珠.超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27（5）：489-492.

[4] 王常順，劉永利，王曉蕾. UPLC、HPLC 測定血栓通注射液中5個皂苷類成分含量的比較研究[J].藥物分析雜志， 2013，33（9）：1617-1620.

[5] 鄭繼標(biāo)，陳麗蓮.HPLC法測定復(fù)方消脂膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及三七皂苷R1的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2011，7（11）：29-32.

[6] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015．

[7] 單玲玲，靳光乾，劉善新.UPLC、RRLC及UFLC在中藥質(zhì)量控制中的研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（10）：2340-2344.

[8] 叢竹鳳， 高鵬. HPLC測定復(fù)方血栓通膠囊中人參皂苷Rg1 Rb1和三七皂苷R1的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志，2010， 37（3）：509-511

[9] 張凱，尹子郡，張躍進，等.HPLC法測定復(fù)方烏骨藤膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2016，31（1）：250-253.

[10] 姚曦，何偉，李勇，等.HPLC法測定復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Rb1的含量[J].中國藥房，2011，22（15）：1398-1400.

[11] 王常順，劉永利，王曉蕾，等.UPLC、HPLC測定血栓通注射液中5 個皂苷類成分含量的比較研究[J].藥物分析雜志，2013，33（9）：1617-1620.

[12] 劉丹，齊雙輝，馬海英.UPLC在中藥組分分析及代謝組學(xué)中的應(yīng)用進展[J].中國藥房，2016，27（7）：973-975.

[13] 林蘇娜，余楚欽，林華慶，等.UPLC 測定參麥注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（8）：48-50.

[14] 朱立，劉霞，蔡鐘欽，等. UPLC 測定大半夏湯中人參皂苷Rg1、Rb1含量[J].中國中醫(yī)藥科技， 2015，22（6）：652-653.

[15] 張玉婷，馮克然，曹進，等. UPLC法評價多種人參提取物中人參皂苷的含量[J].食品科學(xué)，2013，34（24）：102-106.

Simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and notoginsenoside R1 in Fufang Sanqi capsule by UPLC

ZHU Ying SHI Da
Drug Inspection, Nanjing Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210038, China

Objective To determine ginsenoside Rg1, Re, Rb1and notoginsenoside R1in Fufang Sanqi capsule by UPLC. Methods UPLC was performed on a ACQUITY BEH C18column(2.1mm×100mm, 1.7μm) at 25℃. Acetonitrile- water gradient elution was applied at the flow rate of 0.45ml /min. The detection wavelength was 203nm. Results Ginsenoside Rg1, Re, Rb1and notoginsenoside R1were thoroughly separated with the related substances. The linear ranges were 19.61～ 392.2μg/mL(r=0.9997), 4.813～ 96.26μg/mL(r=0.9998),19.92～ 398.4 μg/mL (r=0.9998) and 4.850～97.00μg/mL(r=0.9999), the average recoveries (n=9) were 100.00%, 99.78%, 99.92% and 99.83% with RSD of 0.30%, 0.45%, 0.29% and 0.54%. Conclusion The method is fast, efficient, and it is suitable for determining ginsenoside Rg1, Re, Rb1and notoginsenoside R1in Fufang Sanqi capsule.

UPLC; Fufang Sanqi capsule; Ginsenoside

R927.2

A

2095-0616（2016）17-33-04

▲

（2016-06-28）