不同酵母發(fā)酵的可可果酒香氣成分分析

房一明　李恒　胡榮鎖　賀書珍　賴劍雄　譚樂和

摘 要 以可可鮮豆為原料，選取釀酒曲増香高產(chǎn)型、葡萄酒/果酒專用型、32762、1425、1557、葡萄酒/果酒高活性型、1793共7種釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，利用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分別對7種可可果酒不同發(fā)酵階段的香氣成分進(jìn)行比較。結(jié)果表明：發(fā)酵2周時，酒液中檢出的香氣成分分別為41、47、37、39、36、50、35種，其中葡萄酒/果酒高活性型釀制的果酒中香氣成分種類較多；可可果酒中香氣成分以醇類和酯類為主，主要的酯類成分為辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯，醇類中乙醇和苯乙醇存在較多，其中苯乙醇為呈香成分，這些特征香氣成分賦予了可可果酒獨(dú)特的風(fēng)味。通過儀器測定和嗅聞感官綜合判斷，葡萄酒/果酒專用型、葡萄酒/果酒高活性型發(fā)酵的可可果酒香氣和口感較好，適宜大眾口味。

關(guān)鍵詞 可可果酒 ；釀酒酵母 ；固相微萃取 ；氣質(zhì)聯(lián)用 ；香氣組成

中圖分類號 TS207.3 ；TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.016

Abstract Fresh cocoa beans were fermented as raw materials with 7 strains of wine-brewing yeast： the flavoring high yield yeast strain， grape wine/ ratafia special strain， 32762， 1425， 1557， highly active grape wine/ratafia strain， and 1793， and the aroma components of cocoa wines fermented with different yeast strains were analyzed and compared by using the solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrum. The results showed that the cocoa wines fermented with the 7 yeast strains for two weeks contained 41， 47， 37， 39， 36， 50 and 35 aroma components， respectively. The aroma composition of cocoa wines fermented with the highly active grape wine/ratafia strain had more aroma components. The main aroma components of cocoa wines were alcohols and esters. The main esters included ethyl octanoate， ethyl decanoate， ethyl benzene， phenethylacetate， 9- hexadecenoic acid ethyl ester， and the main alcohols consisted of alcohol and phenethyl alcohol. Among the alcohols， phenethyl alcohol was an important aroma ingredient. All these aroma components gave the unique flavor to the cocoa wines. The instrumental analysis and sensory evaluation of the cocoa wines showed that the cocoa wines fermented with the grape wine/ratafia special strain and the highly active grape wine/ ratafia strain gave excellent aroma and are favored by the public.

Keywords cocoa wines ； saccharomyces cerevisiae ； solid-phase microextraction ； gas chromatography-mass spectrometry ； aromatic composition

可可是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，因具有獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，被廣泛應(yīng)用于巧克力、煙草和休閑食品中，也被應(yīng)用于飲料、化妝品和醫(yī)藥品中[1]。可可果為莢果，果實(shí)中有種子30～40粒，種子外層有果肉包圍[2]。可可果肉營養(yǎng)豐富，其中含有蛋白質(zhì)、糖、維生素C、維生素B2、氨基酸，還含有多種人體必需的礦物元素如鋅、磷、鉀、鈉、鈣、鐵、鎂等[3]。

果酒是以植物果實(shí)為原料，經(jīng)發(fā)酵釀制而成的低酒精度飲料[4]。果酒在發(fā)酵過程中，內(nèi)部發(fā)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，再通過陳釀貯藏使酒香濃郁、色澤紅潤、酸甜可口，得到高質(zhì)低度的飲料酒。果酒品質(zhì)不僅取決于釀酒果實(shí)的優(yōu)質(zhì)程度和生產(chǎn)工藝，對酵母也有要求，發(fā)酵穩(wěn)定、性質(zhì)突出的酵母能夠保證發(fā)酵酒香氣迷人，質(zhì)量高[5]。發(fā)酵型果酒含糖量低，保持了水果的特有香氣和天然營養(yǎng)成分，適量飲用可舒經(jīng)活絡(luò)，調(diào)整新陳代謝，促進(jìn)血液循環(huán)，具有較強(qiáng)的保健作用[6-7]。香氣為果酒品質(zhì)的主要評價指標(biāo)之一，香氣的好壞直接影響著果酒的風(fēng)味品質(zhì)和消費(fèi)者的選購心里[8]。

固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用在果汁發(fā)酵果酒香氣成分分析均有報道[9-15]。近年來，水果發(fā)酵酒成為國家重點(diǎn)發(fā)展的酒種之一。中國酒業(yè)協(xié)會也將重點(diǎn)發(fā)展水果發(fā)酵酒和水果蒸餾酒[16]，而有關(guān)發(fā)酵可可果酒香氣成分變化的研究未見報道。目前可可鮮果副產(chǎn)物利用水平低，鮮果若不及時進(jìn)行初加工，可造成大量鮮果腐爛，通過釀酒對可可果肉進(jìn)行精深加工具有很大的發(fā)展?jié)摿Α榇耍驹囼?yàn)研究不同釀酒酵母發(fā)酵的可可果酒在不同發(fā)酵時期的香氣成分變化規(guī)律，為可可果肉精深加工和副產(chǎn)物綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

可可鮮果由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供：釀酒酵母1973、1425、32762、1557購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）：釀酒曲増香高產(chǎn)型、葡萄酒/果酒專用型、葡萄酒/果酒高活性型酵母購自湖北安琪酵母有限公司：果膠酶購自天津利華酶制劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：ISQ，美國賽默飛；臺式恒溫振蕩器：TCYQ，蘇州培英；自動蒸汽消毒機(jī)：G154DW，廈門致微；電子天平：AL104，美國METTLER TOLEDO。

1.2 方法

1.2.1 可可發(fā)酵酒的制備

（1）原料處理：選取新鮮、無蟲害腐爛的可可鮮豆，按質(zhì)量比1∶1比例加入純凈水；

（2）酶解：混合均勻，添加1‰ 果膠酶，40℃酶解60 min；

（3）調(diào)配：調(diào)整初始糖度為22° Brix；

（4）滅菌：115℃滅菌10 min得發(fā)酵原料液；

（5）接種發(fā)酵：在超凈工作臺中，分別接種不同酵母，酵母的加入量為發(fā)酵原料與水總質(zhì)量的0.02%，接種后置于恒溫振蕩器中，溫度設(shè)定為20℃，分別于發(fā)酵1～3周時定期取樣，取樣后經(jīng)滅活、過濾后待測。

1.2.2 SPME-GC-MS測定

分別移取果酒樣品3 mL置于10 mL固相萃取瓶中，萃取溫度為60℃，萃取時間為50 min。升溫程序：40℃保持2 min，以2℃/min速度升溫至140℃，保持1 min，再以10℃/min速度升溫至230℃，保持2 min。質(zhì)譜傳輸線溫度為240℃，離子源溫度為250℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500，毛細(xì)管柱為TR-WAXMS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.2.3 定性與定量分析

各離子流色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計算機(jī)譜庫NIST 05、Mainlib和Replib進(jìn)行檢索，同時采用峰面積歸一化法計算可可果酒中各階段揮發(fā)性成分的相對含量。

1.2.4 成品酒感官分析

完成發(fā)酵后的果酒經(jīng)過濾除去殘渣，獲得可可原果酒，經(jīng)陳釀和澄清后獲得可可果酒。根據(jù)國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析，取適量成品果酒倒入紅酒杯中，采用目測、鼻嗅、口嘗的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種酵母發(fā)酵可可果酒樣GC/MS的總離子流

用氣質(zhì)聯(lián)用儀分別對7種不同釀酒酵母發(fā)酵的可可果酒進(jìn)行分析，得出GC-MS總離子流圖（圖1）。各離子流色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計算機(jī)譜庫檢索并與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照，并結(jié)合已有的報道結(jié)果進(jìn)行定性分析，確定可可果酒的化學(xué)成分。根據(jù)校正面積歸一化法對相應(yīng)香氣成分對應(yīng)峰進(jìn)行定量，結(jié)果見圖1和表1。

2.2 7種酵母分別發(fā)酵可可果酒GC-MS分析

由圖2～3結(jié)果分析得知，發(fā)酵1周時，釀酒曲増香高產(chǎn)型酵母發(fā)酵的可可果酒共檢出44種香氣成分，葡萄酒/果酒專用型共檢出46種，32762型共檢出46種，1425型共檢出42種，1557型共檢出40種，葡萄酒/果酒高活性型共檢出44種，1973型共檢出46種。7種果酒中醇類物質(zhì)分別占香氣成分總量的78.18%、68.99%、72.70%、77.92%、70.15%、74.77%、72.20%，酯類分別占18.80%、27%、22.84%、16.46%、26.28%、20.5%、24.11%，其它為酸類、酮類、萜烯類等。其中醇類物質(zhì)中乙醇、苯乙醇的相對含量較高，苯乙醇具有花香，不同于其它醇類物質(zhì)的是苯乙醇不僅有一定的殺菌作用，并且會發(fā)出誘人且清甜的茉莉花香和玫瑰樣花香，給人柔和愉悅的感受[19]。

由圖4～5結(jié)果分析得知，發(fā)酵2周時，釀酒曲増香高產(chǎn)型酵母發(fā)酵的可可果酒共檢出41種香氣成分，葡萄酒/果酒專用型共檢出47種，32762型共檢出37種，1425型共檢出39種，1557型共檢出36種，葡萄酒/果酒高活性型共檢出50種，1973型共檢出35種。7種果酒中醇類物質(zhì)分別占香氣成分總量的75.72%、75.40%、70.97%、73.71%、70.91%、70.78%、91.20%，酯類分別占20.01%、20.73%、26.37%、22.91%、24.50%、24.02%、4.47%。

由圖6～7結(jié)果分析得知，發(fā)酵3周時，釀酒曲増香高產(chǎn)型酵母發(fā)酵的可可果酒中共檢出43種香氣成分，葡萄酒/果酒專用型共檢出44種，32762型共檢出46種，1425型共檢出45種，1557型共檢出36種，葡萄酒/果酒高活性型共檢出44種，1973型共檢出42種。7種果酒中醇類物質(zhì)分別占香氣成分總量的76.20%、71.74%、67.21%、75.81%、68.73%、72.93%、87.34%，酯類分別占20.45%、23.85%、27.73%、20.99%、26.32%、22.12%、7.58%。

2.3 7種酵母發(fā)酵可可果酒GC-MS香氣成分分析

醇類和酯類物質(zhì)為果酒中主要的成分，酯類物質(zhì)為果酒中主要的呈香成分。由表1中得知，共檢出酯類物質(zhì)29種，其中共有的酯類物質(zhì)有5種，分別為辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。共檢出醇類物質(zhì)21種，其中乙醇、苯乙醇相對含量較多。多數(shù)酯類具有花、果香氣，如己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型香氣，苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香、蘋果香、蜂蜜香、可可和威士忌樣的香韻，月桂酸乙酯具有花果香氣，辛酸乙酯具有令人愉快的花果、杏子香氣，癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣，肉豆蔻酸乙酯具有椰子和鳶尾似香氣，棕櫚酸乙酯具有果香、奶油香氣[17-18]。

2.4 不同酵母發(fā)酵可可果酒的感官評價

通過儀器測定能確定酒中各香氣成分的相對含量，但酒的風(fēng)味物質(zhì)種類并不是越多越好，而是主要風(fēng)味物質(zhì)的含量相對平衡，所以很難判斷實(shí)際口感需求，對酒的風(fēng)味鑒評還需要結(jié)合人工感官品評，感官分析是指評價員通過用口、眼、鼻等感官特性，對果酒的色澤、香氣、口味等感官特性進(jìn)行分析與評定，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，選擇葡萄酒/果酒專用型酵母、葡萄酒/果酒高活性型酵母釀造的果酒在色澤、香氣、風(fēng)味、口感、酒質(zhì)上均要優(yōu)于其它酵母釀造的產(chǎn)品。

3 結(jié)論

利用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析檢測不同釀酒酵母發(fā)酵果酒的香氣成分，其中醇類、酯類物質(zhì)種類較多，酸類、萜烯類、酮類、烷烴類等物質(zhì)種類較少。采用不同酵母發(fā)酵可可果酒的風(fēng)味有一定差異，結(jié)合嗅聞感官綜合判斷，葡萄酒/果酒專用型酵母和葡萄酒/果酒高活性型酵母發(fā)酵的果酒香氣和口感較好。葡萄酒/果酒專用型酵母發(fā)酵果酒中酯類物質(zhì)17種、醇類14種，葡萄酒/果酒高活性型酵母發(fā)酵果酒中酯類物質(zhì)17種、醇類物質(zhì)14種。可可果酒中主要呈香的酯類成分有辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯，醇類成分中乙醇和苯乙醇存在較多。

參考文獻(xiàn)

[1] 房一明，谷風(fēng)林，初眾等. 發(fā)酵方式對海南可可豆特性和風(fēng)味的影響分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，32（2）：71-75.

[2] GU F L， TAN L H， WU H S， et al. Comparison of Cocoa Beans from China， Indonesia and Papua New Guinea[J]. Food， 2013， （2）： 183-197.

[3] 賴劍雄，王 華，趙溪竹，等. 可可栽培與加工技術(shù)[J]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014：11.

[4] 張 妮. 櫻桃酒致香成分的研究及發(fā)酵工藝對其香氣成分的影響[D]. 上海：華東理工大學(xué)碩士論文，2011：12.

[5] 王家利，辛秀蘭，陳 亮，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法分析比較不同酵母發(fā)酵紅樹莓果酒的香氣成分[J]. 食品科學(xué)，2014，35（6）：107-112.

[6] 賈青青，邵威平，辛秀蘭，等. 黑加侖果與果酒香氣成分的GC-MS分析[J]. 中國釀造，2014，33（3）：141-146.

[7] 劉永衡，蔡 倩，吳桂君.幸運(yùn)李子果酒香氣成分分析[J].中國釀造，2015，34（10）：138-141.

[8] 李 銳，馮 奎，吳 婧，等. 不同來源釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響[J]. 食品科學(xué)，2010，31（17）：206-213.

[9] 李 靜.果酒釀造中優(yōu)良酵母菌株的篩選[J]. 釀酒，2008，35（2）：63-65.

[10] Torrens J， Urpi P， Riu A M， et al. Different commercial yeast strains affecting the volatile and sensory profile of cava base wine[J]. International journal of food microbiology， 2008， 124（1）： 48-57.

[11] Wang X， Xie K L， Zhuang H N， et al. Volatile flavor compounds， total polyphenolic contents and antioxidant activities of a China gingko wine[J]. Food Chemistry， 2015， 182： 41-46.

[12] 劉樹文，涂正順，李 華，等.獼猴桃果酒陳釀期間香氣成分的變化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，33（11）：34-38.

[13] 楊 旭，陳 亮，辛秀蘭，等. 果汁發(fā)酵和帶渣發(fā)酵藍(lán)靛果酒香氣成分分析[J]. 食品科學(xué)，2014，35（12）：115-119.

[14] Wang L， Xu Y， Zhao G， et al. Rapid analysis of flavor volatiles in apple wine using headspace solid-phase microextraction[J]. Journal of the Institute of Brewing， 2004， 110（1）： 57-65.

[15] Fan W L， Qian M C. Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-olfactometry dilution analysis of young and aged Chinese “Yanghe Daqu” liquors [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（20）： 7 931-7 938.

[16] 周 元，賁 浩，傅虹飛. 酵母菌株對獼猴桃果酒香氣成分的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技，2014，30（12）：263-270.

[17] 陳 亮，危 晴，辛秀蘭，等. 不同酵母發(fā)酵對獼猴桃果酒香氣成分的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2015，36（5）：100-106.

[18] 邱松山，王彥安，黃可怡，等.龍眼果酒品質(zhì)及香氣成分的GC-MS分析[J]. 釀酒科技，2015，（12）：108-112.

[19] 楊 旭，陳 亮，辛秀蘭，等. 果汁發(fā)酵和帶渣發(fā)酵藍(lán)靛果酒香氣成分分析[J].食品科學(xué)，2014，35（12）：115-119.