極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis胞外硫活化蛋白質(zhì)基因的篩選及鑒定

馬亞龍劉紅昌夏金蘭，2楊云聶珍媛，2

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083；2. 中南大學(xué)教育部生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410083）

極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis胞外硫活化蛋白質(zhì)基因的篩選及鑒定

馬亞龍1劉紅昌1夏金蘭1，2楊云1聶珍媛1，2

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083；2. 中南大學(xué)教育部生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410083）

以極端嗜酸熱古菌（Acidianus manzaensis）為研究對(duì)象，基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法篩選和鑒定了13個(gè)A. manzaensis胞外與硫活化相關(guān)的蛋白質(zhì)基因，并從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。首先通過80℃緩慢搖動(dòng)水浴30 min分別對(duì)A. manzaensis在單質(zhì)硫（S0）和亞鐵（Fe2+）為能源底物進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)的胞外蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，并用雙向電泳（2-DE）進(jìn)行分離，然后選取在S0底物下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）鑒定和生物信息學(xué)分析及功能預(yù)測(cè)，最后用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）對(duì)篩選得到的胞外S0活化相關(guān)蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證；最終獲得了13個(gè)極端嗜酸熱古菌A. manzaensis胞外活化S0相關(guān)的蛋白質(zhì)基因。篩選得到的蛋白質(zhì)中一半以上含有較多的半胱氨酸殘基（Cys），說明胞外富含巰基（-SH）的蛋白參與了S0活化；其中谷氧還蛋白（glutaredoxin）和FAD鍵合氧化酶均含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域，且兩種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)量較高，說明含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在極端嗜酸熱古菌A. manzaensis活化S0的過程中起重要的作用。

Acidianus manzaensis；比較蛋白質(zhì)組學(xué)；胞外蛋白質(zhì)；硫活化

硫化礦生物浸出技術(shù)在復(fù)雜低品位原生硫化礦生物提取、金礦表面硫化礦的氧化預(yù)處理、以及硫化礦尾礦的治理和金屬回收等方面可以發(fā)揮重大作用［1］。常見的硫化礦生物浸出微生物可根據(jù)其最適生長(zhǎng)溫度劃分為常溫微生物（30-40℃）、中度嗜熱微生物（40-60℃）和極端嗜熱微生物（80℃以上）［2］。由于嗜熱菌與嗜中溫菌相比具有耐高溫、提取速率快和浸出率高等特點(diǎn)，在工業(yè)應(yīng)用上有著較大的潛力。然而目前關(guān)于嗜酸熱古菌-硫化礦作用下的硫氧化過程研究極少，人們對(duì)嗜酸熱古菌硫氧化過程與高溫生物浸出的關(guān)系缺乏清晰的認(rèn)識(shí)和了解［3］。

單質(zhì)硫（S0）的生物氧化過程十分復(fù)雜，基于對(duì)典型中溫菌Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270的研究表明，S0必須經(jīng)過嗜酸硫氧化菌胞外蛋白對(duì)其有效的活化作用，并經(jīng)膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間后，才能被細(xì)菌有效地氧化［4］。在這幾個(gè)步驟中胞外蛋白對(duì)S0的活化作用起著重要的作用，決定著整個(gè)S0氧化過程效率的高低，并且已有研究表明S0的活化需要胞外和外膜上富含巰基（-SH）蛋白的參與反應(yīng)形成-SnH（n ≥ 2）的復(fù)合體才能進(jìn)一步被氧化［5，6］。我們課題組之前基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)和同步輻射的原位巰基表征，驗(yàn)證了-SH在中溫菌A. ferrooxidans硫活化中的重要作用［7，8］。由于嗜酸熱古菌具有獨(dú)特的生理生化特性，其S0的活化機(jī)制及其與A. ferrooxidans的區(qū)別與聯(lián)系還不清楚，因此，進(jìn)一步基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法開展嗜酸熱古菌胞外S0活化相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選和作用機(jī)制的研究，有助于揭示嗜酸熱古菌對(duì)S0的活化途徑和氧化利用機(jī)制［9，10］。

本研究基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)典型極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis進(jìn)行研究，以期獲得A. manzaensis菌胞外與S0活化相關(guān)的蛋白質(zhì)基因，為以后闡明嗜酸熱古菌硫活化氧化機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑有丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，苯甲基磺酰氟（PMSF），十二烷基硫酸鈉（SDS），過硫酸銨，甘氨酸，考馬斯亮藍(lán)G-250，考馬斯亮藍(lán)R-250，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺，Tris-堿，溴酚藍(lán)，尿素，硫脲，丙三醇，丙酮，8-10 kD透析袋等均購自于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；固相pH梯度干膠條（IPG干膠條，pH3-10，24 cm）IPG buffer（pH3-10）Ettan IP Gphor 3等電聚焦系統(tǒng)和電泳系統(tǒng)均購自于GE公司；質(zhì)譜鑒定在串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800 MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX）上完成；TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和TIANamp總RNA提取試劑盒均購自于天根生化科技有限公司；ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒，HUNDERBIRDTM SYBR? qPCR Mix均購自于日本東洋紡株式會(huì)社生命科學(xué)事業(yè)部（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）；RT-qPCR在 iCycler iQTM Realtime PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上完成。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基 菌株A. manzaensis YN-25由中南大學(xué)生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供［11］，A. manzaensis培養(yǎng)于9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基（0.5 g/L，MgSO4·7H2O；0.5 g/L，K2HPO4；3.0 g/L，（NH4）2SO4；0.1 g/L，KCl；0.01 g/L，Ca（NO3）2），添加0.02%（W/V）酵母浸出液，并分別加入10 g/L的S0、20 g/L的FeSO4·7H2O作為能源底物。A. manzaensis菌在S0為能源底物時(shí)初始pH用硫酸調(diào)為2.0，在Fe2+為能源底物培養(yǎng)時(shí)的初始pH調(diào)為1.5；取200 mL上述培養(yǎng)基于500 mL的三角瓶中在121℃滅菌鍋中滅菌 20 min。A. manzaensis的初始接種量均為107個(gè)/mL，置于65℃、170 r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，4℃下10 000×g離心15 min收集細(xì)胞，菌體先用pH2.0的稀硫酸輕輕震蕩洗滌除去雜質(zhì)后離心收集菌體，然后懸浮于pH7.3的磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

1.2.2 不同能源底物下生長(zhǎng)的A. manzaensis胞外蛋白質(zhì)的提取 胞外硫活化蛋白的提取采取80℃熱水浴加熱的方法［12］，并以Fe2+為能源底物下培養(yǎng)的A. manzaensis提取的胞外蛋白質(zhì)作為對(duì)照篩選出與硫活化相關(guān)的胞外蛋白質(zhì)。具體步驟如下：（1）分別將在Fe2+和S0培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期下收集的細(xì)胞懸液于80℃水浴條件下緩慢搖動(dòng)孵育；（2）4℃下10 000×g離心15 min收集上清液即為胞外蛋白質(zhì)；（3）向胞外

蛋白質(zhì)溶液中加入4倍體積的冷丙酮，并于 -20℃下過夜靜置沉淀蛋白質(zhì)；（4）將第（3）步中用丙酮沉淀產(chǎn)生的蛋白質(zhì)于 4℃下10 000×g 離心30 min，棄上清，加入適量超純水溶解沉淀所得蛋白質(zhì)，置于8-10 kD的透析袋中用滅菌的超純水透析96 h（每12 h換一次水）；（5）透析后的蛋白質(zhì)經(jīng)冷凍干燥后溶解于裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，1% NP-40，2% IPG緩 沖 液，65 mmol/L DTT），Bradford法［13］測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后于-80℃保存?zhèn)溆谩榇_定最佳的水浴時(shí)間在步驟（1）中選取不同的水浴處理時(shí)間，對(duì)離心收集到的上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其中的蛋白濃度，并繪制水浴時(shí)間和胞外蛋白質(zhì)含量圖。

1.2.3 雙向電泳分離蛋白質(zhì) 雙向電泳采用固相pH梯度干膠條（pH3-10，24 cm），上樣量為 500 mg。分別將上述A. manzaensis在S0/Fe2+為能源底物時(shí)提取得到的含500 mg蛋白質(zhì)裂解液與600 μL水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，1% NP-40，0.5% IPG緩沖液，18 mmol/L DTT以及0.002%的溴酚藍(lán)）充分混勻后采用膠內(nèi)水化上樣方式上樣［14］。等電聚焦結(jié)束后取出膠條，將 IPG膠條于10 mL平衡緩沖液（6 mol/L 尿素，2% SDS，50 mmol/L、pH8.8 Tris-HCl，30%甘油，0.002%溴酚藍(lán)）中水平搖床振動(dòng)平衡兩次，每次15 min。第一次在10 mL平衡緩沖液中加入1% DTT；第二次在10 mL 平衡緩沖液中加入2.5%碘乙酰胺。平衡好的膠條移至12.5% 聚丙烯酰胺凝膠上端，上部用0.5 %低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠后進(jìn)行二向垂直平板SDS-PAGE。取出電泳結(jié)束后的第二向SDS-PAGE用考馬斯亮蘭R-250染色。

1.2.4 A. manzaensis胞外硫活化相關(guān)蛋白質(zhì)膠內(nèi)水解與質(zhì)譜鑒定 采用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件對(duì)雙向電泳分離得到的圖譜進(jìn)行分析，以Fe2+為能源底物的電泳圖譜作為對(duì)照，篩選出在以S0為能源底物時(shí)差異表達(dá)的斑點(diǎn)，選擇挖取蛋白質(zhì)點(diǎn)，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，用去離子水反復(fù)清洗后進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)膠塊脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)胰蛋白酶水解［15］。質(zhì)譜鑒定采用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800 MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX）進(jìn)行測(cè)試分析，參數(shù)設(shè)定：Nd：YAG激光器發(fā)射激光源波長(zhǎng)355 nm，加速電壓 2.0 kV；采集數(shù)據(jù)時(shí)用正離子模式以及自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)模式；其中一級(jí)質(zhì)譜（MS）范圍為 800-4 000 Da，根據(jù)MS結(jié)果選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，每組實(shí)驗(yàn)樣品選擇 8個(gè)母離子，MS/MS累計(jì)疊加2 500 次，碰撞能量2.0 kV，CID閉。

1.2.5 數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì) 質(zhì)譜測(cè)試后獲得的原始文件用Mascot 2.2 軟件檢索NCBI和Swissprot數(shù)據(jù)庫，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，檢索鑒定的蛋白質(zhì)參考NCIB（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫公布的信息進(jìn)行功能分類和生物信息學(xué)分析［16］。

1.2.6 RT-qPCR驗(yàn)證篩選蛋白質(zhì)在硫活化中的作用 以數(shù)據(jù)庫檢索鑒定的A. manzaensis在S0為能源底物時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)的胞外蛋白基因，采用Primer 3（v.0.4.0）（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ primer3/）在線設(shè)計(jì)引物并由上海生工公司合成，用于RT-qPCR的細(xì)胞收集于對(duì)數(shù)中期?？俁NA的提取和純化采用總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），然后立刻以總RNA作為模板用ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，均按試劑盒說明操作。以上述反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，使用高效率SYBR 熒光定量PCR mix QPK-201（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）配制反應(yīng)體系后在iCycler iQTM Real-time PCR儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。對(duì)RT-qPCR采集的數(shù)據(jù)，用 16S rDNA基因作為內(nèi)部參照校正，用（1+E）-ΔΔCq法進(jìn)行計(jì)算（其中E為擴(kuò)增效率，Cq值為熒光信號(hào)達(dá)到域值時(shí)的循環(huán)數(shù)），分析各個(gè)基因在不同能源底物培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)表達(dá)量［17］。

2 結(jié)果

2.1 熱水浴法提取胞外蛋白時(shí)間的確定

通過測(cè)定水浴時(shí)間和上清液中胞外蛋白質(zhì)含量所得的關(guān)系圖（圖1）可知，A. manzaensis分別在S0和Fe2+生長(zhǎng)時(shí)收集的相同體積菌懸液（在600 nm波長(zhǎng)下吸光值均為1），在80℃水浴中緩慢搖動(dòng)孵育時(shí)均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)胞外蛋白的提取量增多，而且由圖1還可知A. manzaensis在S0中生長(zhǎng)時(shí)的胞外蛋白質(zhì)含量明顯高于在以Fe2+為能源底物時(shí)的胞外

蛋白質(zhì)含量，說明在在S0能源底物下A. manzaensis分泌更多的胞外蛋白質(zhì)。水浴30 min后蛋白質(zhì)含量均不再增加，因此為保證在既能充分提取胞外蛋白又不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壞的前提下，選擇80℃水浴時(shí)間30 min提取胞外蛋白質(zhì)。

圖1 80℃水浴時(shí)間和A. manzaensis分別在S0（A）和Fe2+（B）能源底物下生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞胞外蛋白質(zhì)提取量關(guān)系圖

2.2 A. manzaensis在S0/Fe2+能源底物下胞外蛋白質(zhì)的 2-DE差異圖譜

A. manzaensis 在S0/Fe2+能源底物下胞外蛋白質(zhì)的2-DE差異圖譜如圖2所示。分析2-DE圖譜可知當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為500 mg時(shí)在8 000 V下等點(diǎn)聚焦10 h可以得到清晰的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，無明顯的拖尾情況，高豐度的蛋白質(zhì)能有效的分離，而且低豐度的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)也能完全展示，說明該2-DE差異圖譜可以進(jìn)一步用于后續(xù)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的篩選和質(zhì)譜鑒定，從而獲得出與S0活化相關(guān)的胞外蛋白質(zhì)信息。

圖2 A. manzaensis分別在S0（A）和Fe2+（B）能源底物下生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞胞外蛋白質(zhì)2-DE圖譜

通過采用ImageMaster 2D Platinum 6.0版本軟件對(duì)雙向電泳分離得到的圖譜進(jìn)行分析可知，A. manzaensis 分別在S0和Fe2+能源底物下生長(zhǎng)的胞外蛋白質(zhì) 2-DE圖譜存在顯著的差異，這表明細(xì)胞在這兩種能源底物中生長(zhǎng)時(shí)，有各自的代謝機(jī)制從而誘導(dǎo)表達(dá)不同的胞外蛋白質(zhì)。分析結(jié)果表明S0能源底物下的胞外蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（圖2-A）在 55-72 kD、34-43 kD和17 kD范圍附近展現(xiàn)出很多，在Fe2+（圖2-B）底物下沒有的斑點(diǎn)，說明這部分蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞對(duì)S0的活化相關(guān)。例如，圖2-A中序號(hào)14箭頭所指的斑點(diǎn)雖然在Fe2+底物中（圖2-B）也有表達(dá)，但是在S0為能源底物下表達(dá)量明顯上調(diào)，說明也與S0的活化緊密相關(guān)。通過比較分析2-DE差異圖譜后，選擇性挖取 15個(gè)只有在S0能源底物中表達(dá)和表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（圖 2-A中用箭頭指示并標(biāo)

注斑點(diǎn)序號(hào)）進(jìn)行膠內(nèi)水解與MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。

2.3 A. manzaensis胞外S0活化蛋白的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析

基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選的A. manzaensis菌胞外S0活化相關(guān)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)過膠內(nèi)酶切，然后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF分析和指紋鑒定，得到結(jié)果如表1所示。值得注意的是，雖然一共挖取了15個(gè)蛋白斑點(diǎn)，但是其中4號(hào)和6號(hào)斑點(diǎn)均為ATP酶（ATPase），9號(hào)和10號(hào)斑點(diǎn)鑒定均為個(gè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase），表明該蛋白質(zhì)有不同的同分異構(gòu)體存在，構(gòu)象異構(gòu)的差異導(dǎo)致了等電點(diǎn)的輕微不同；其次鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中有2個(gè)ATP酶（ATPase）同功酶（3號(hào)和4/6號(hào)斑點(diǎn)），3個(gè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）同功酶（9/10，11和12號(hào)斑點(diǎn)），同功酶是由不同基因編碼的蛋白質(zhì)，它們能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但分子結(jié)構(gòu)和生理功能有所不同的一類酶。對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行匯總分析可知，所篩選的 13個(gè)S0活化相關(guān)蛋白質(zhì)中有2個(gè)保守的未知功能的蛋白質(zhì)斑 點(diǎn)（Conserved hypothetical protein），2個(gè)ATP酶（ATPase）同功酶，1個(gè)D-粘酸脫水酶（D-galactarate dehydratase），1個(gè)葡萄糖內(nèi)酯酶（gluconolaconase），1個(gè)FAD氧化酶（FAD-linked oxidase），3個(gè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）同功酶，1 個(gè)谷氧還蛋白（glutaredoxin），一個(gè)DsrE 家族蛋白質(zhì)和1個(gè)硫氧還蛋白（sulfur reduction protein DsrE）。通過鑒定所得到的13個(gè)蛋白質(zhì)中經(jīng)分析可知共有9個(gè)蛋白質(zhì)富含Cys殘基，并且其中g(shù)lutaredoxin和FAD-linked oxidase均含有一個(gè)或者一個(gè)以上的-CXXC-結(jié)構(gòu)域，說明胞外富含巰基（-SH）的蛋白質(zhì)及含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能參與了S0活化過程。

表1 基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的A. manzaensis菌胞外硫活化相關(guān)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)鑒定結(jié)果

2.4 RT-qPCR對(duì)篩選的S0活化相關(guān)蛋白質(zhì)驗(yàn)證

根據(jù)質(zhì)譜鑒定和Mascot檢索篩選得到S0活化相關(guān)蛋白質(zhì)后查找到對(duì)應(yīng)的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，引物信息如表2所示，以提取的A. manzaensis菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示所有設(shè)計(jì)的基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一明亮的條帶，說明所設(shè)計(jì)的引物特異性較好，而且產(chǎn)物分子量也和理論擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致，經(jīng)測(cè)序確定為目的基因，可用于后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。

A. manzaensis菌分別在S0硫和Fe2+中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及cDNA第二鏈的合成后，以cDNA為模板，利用表2中的引物序列進(jìn)行RT-qPCR。細(xì)胞在S0/Fe2+不同能源底物下相關(guān)

基因的表達(dá)差異用各自16S rDNA基因作為內(nèi)參校正RT-qPCR操作中的隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，結(jié)果用lb［S0/Fe2+］±SD表示。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析當(dāng)lb［S0/ Fe］±SD的值大于1時(shí)，表明該基因的表達(dá)量在以S0能源底物時(shí)明顯上調(diào)，篩選得到的胞外蛋白質(zhì)基因RT-qPCR表達(dá)結(jié)果見表3。RT-qPCR結(jié)果表明通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選得到的A. manzaensis菌胞外蛋白質(zhì)基因的表達(dá)量在S0能源底物中均顯著高于在Fe2+能源底物中，說明篩選到的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上均顯著表達(dá)上調(diào)，從而驗(yàn)證了雙向電泳結(jié)果，進(jìn)一步證明所篩選的蛋白質(zhì)在S0活化中起重要作用。

表2 基于MALDI-TOF MS/MS鑒定和Mascot數(shù)據(jù)數(shù)篩選的蛋白基因的引物序列信息

3 討論

細(xì)胞對(duì)S0吸附和活化是整個(gè)S0生物氧化過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，被認(rèn)為是整個(gè)生物S0氧化的限速步驟。胞外物質(zhì)很可能介導(dǎo)了細(xì)菌對(duì)疏水性S0的吸附和活化過程［18］。以S0為能源生長(zhǎng)的A. ferrooxidans細(xì)胞表面會(huì)釋放出大量由脂類、多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的外膜泡可能是細(xì)菌與元素硫吸附的“橋梁”［19］。半胱氨酸（Cys）殘基上的巰基（-SH）在生化反應(yīng)中具有特殊性質(zhì)，使得半胱氨酸存在的結(jié)構(gòu)域往往能夠?yàn)樯矬w的一系列生理生化反應(yīng)提供氧化還原對(duì)，成為功能蛋白質(zhì)的氧化還原活性中心［20］。Rohwerder和Sand［21］提出S0活化的模式可能是經(jīng)過細(xì)菌EPS蛋白質(zhì)的活性巰基（P-SH）與環(huán)狀硫作用，形成類似的P-SnH結(jié)構(gòu)化合物（n≥2）（公式1），后者再經(jīng)外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后被氧化。Peng等［22］通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法比較了S0和Fe2+基質(zhì)中生長(zhǎng)的A. ferrooxidans胞外蛋白質(zhì)表達(dá)差異，篩選出了與硫活化相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)絕大多數(shù)含有-SH，并且發(fā)現(xiàn)-CXXC-基序在硫活化中起到非常重要的作用，但是關(guān)于極端嗜酸熱古菌的胞外S0活化蛋白質(zhì)的篩選鑒定沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法找到的13個(gè)與極端嗜酸熱古菌A. manzaensis活化S0相關(guān)的胞外蛋白質(zhì)中，D-粘酸脫水酶是催化產(chǎn)生環(huán)烴類碳水化合物的重要酶類，其表達(dá)量（lb［S0/Fe2+］±SD）為5.76±0.69，說明其可能通過催化合成能吸附到疏水性S0表面的環(huán)烴類碳水化合物（如脂質(zhì)，多糖），在A. manzaensis 適應(yīng)和活化S0中起到“橋梁”的作用。谷氧還蛋白質(zhì)是巰基—二硫鍵氧化還原酶家族的重要組分，在調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)中起到重要作用；生物信息分析發(fā)現(xiàn)谷氧還蛋白質(zhì)和FAD鍵合氧化酶均含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域，并且兩種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)量都非常高，說明含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域的兩種蛋白質(zhì)在極端嗜酸熱古菌A. manzaensis活化S0的過程中也起到重要的作用。硫還原蛋白質(zhì)DsrE在許多還原反應(yīng)中作為氫供體，是一類廣泛存在的作為氫載體的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)［23］。通過生物信

息學(xué)分析表1中的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)約一半以上的蛋白質(zhì)具有較多的半胱氨酸殘基，結(jié)合表3中硫活化相關(guān)蛋白質(zhì)基因的RT-qPCR表達(dá)結(jié)果，表明巰基在A. manzaensis 菌活化氧化S0的過程中起到了非常重要的作用。篩選出來的蛋白質(zhì)中有2個(gè)屬于保守未知功能蛋白且也含有較多的半胱氨酸殘基，它們?cè)诙耸人釤峁啪鶤. manzaensis活化S0的作用有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，在所篩選得到的蛋白質(zhì)中有1個(gè)ATP酶（3號(hào)斑點(diǎn)）和3個(gè)超氧化物歧化酶同功酶（9/10，11和12號(hào)斑點(diǎn)）不含有半胱氨酸殘基，其蛋白質(zhì)基因的表達(dá)量在S0能源底物中也顯著高于在Fe2+能源底物中，說明這部分蛋白質(zhì)也參與了極端嗜酸熱古菌A. manzaensis對(duì)S0的活化過程，但這幾種蛋白質(zhì)在目前已有的中溫菌S0活化過

程中的作用均沒有報(bào)道，說明對(duì)于極端嗜酸熱古菌A. manzaensis而言，其活化S0的過程與典型的中溫菌A. ferrooxidans相比存在差異。推測(cè)其中ATP酶可能在整個(gè)S0的活化過程中為其他的反應(yīng)提供能量；另外3個(gè)不含巰基的超氧化物歧化酶同功酶（9/10，11和12號(hào)斑點(diǎn)）可能通過維持胞外的還原性環(huán)境從而保證巰基（P-SH）的還原性，最終保證胞外EPS蛋白質(zhì)的活性巰基與S0的反應(yīng)（公式1），而且根據(jù)表3可知這幾個(gè)同功酶的表達(dá)上調(diào)倍數(shù)不一樣，說明這幾種酶可能在胞外存在的位置不同，可能分別定位于胞外的莢膜層和粘液層。

圖3 以表2中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

表3 篩選的胞外蛋白質(zhì)基因RT-qPCR表達(dá)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究主要通過基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選和鑒定了13個(gè)A. manzaensis胞外與硫活化相關(guān)的蛋白質(zhì)基因，并從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。篩選得到的蛋白質(zhì)中一半以上含有較多的Cys殘基，說明胞外富含-SH的蛋白參與了S0活化；其中谷氧還蛋白質(zhì)和FAD鍵合氧化酶均含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域，且兩種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)量都非常高，說明含有-CXXC-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在極端嗜酸熱古菌A. manzaensis活化S0的過程中也起到重要的作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of Extracellular Protein Genes Relevant to Sulfur Activation of Extremely Thermoacidophilic Archaea Acidianus manzaensis

MA Ya-long1LIU Hong-chang1XIA Jin-lan1，2YANG Yun1NIE Zhen-yuan1，2
（1. School of Minerals Processing and Bioengineering，Central South University，Changsha 410083；2. Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education，Central South University，Changsha 410083）

This study focused on extremely thermoacidophilic archaea Acidianus manzaensis，13 extracellular protein genes relevant to sulfur activation were screened and identified based on comparative proteomics，and their transcription levels were verified. First of all，extracellular proteins of A. manzaensis growing on elemental sulfur（S0）and ferrous（Fe2+）were extracted by slowly shaking water bath at 80℃ for 30 min，respectively. The proteins were separated by two-dimensional electrophoresis（2-DE）and differentially expressed spots under S0substrate were selected. The selected spots were identified by tandem time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF/TOF），and then analyzed using bioinformatics and functional prediction methods. Finally, the genes of the screened extracellular proteins associated with S0activation were verified by real-time quantitative PCR（RT-qPCR）at transcription levels，and 13 relevant genes were acquired. More than half of the screened proteins contained plenty of cysteine residues（Cys），meaning thiol group（-SH）rich extracellular proteins participated in the process of S0activation. Especially，both glutaredoxin and FAD-linked oxidase contained -CXXC- domain，and their corresponding genes were highly expressed，indicating that the proteins with -CXXC- domain play an important role during the S0activation process of extremely thermoacidophilic archaea A. manzaensis.

Acidianus manzaensis；comparative proteomics；extracellular protein；sulfur activation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.023

2016-08-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51274257）

馬亞龍，男，研究方向：生物冶金；E- mail：yalong_ma@csu.edu.cn

夏金蘭，男，博士，教授，研究方向：生物冶金及能源環(huán)境生物技術(shù)；E- mail：jlxia@csu.edu.cn