豬細小病毒病血清抗體VP2-ELISA檢測方法的建立

周　潔，南文龍，何遠清，殷黎靜，任　倩，秦立得，陳義平?

（1.江蘇大學實驗動物中心，江蘇　鎮江　212013；2.中國動物衛生與流行病學中心診斷試劑室，山東　青島　266032）

豬細小病毒病血清抗體VP2-ELISA檢測方法的建立

周潔1,2，南文龍2，何遠清1，殷黎靜1，任倩1，秦立得2，陳義平2?

（1.江蘇大學實驗動物中心，江蘇鎮江212013；2.中國動物衛生與流行病學中心診斷試劑室，山東青島266032）

利用純化的豬細小病毒VP2蛋白為抗原，建立檢測豬細小病毒血清抗體的間接VP2-ELISA。最佳反應條件為：抗原包被濃度300 ng/孔，4℃過夜，待檢測血清1∶50稀釋。與豬細小病毒病陽性血清呈陽性反應，與豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬日本腦炎和豬圓環病毒病等5種疾病的陽性血清均無交叉反應。批間、批內試驗變異系數均小于10%。用該方法與Ceditest PPV豬細小病毒抗體檢測試劑盒對102份血清進行平行檢測和比較，間接VP2-ELISA的敏感性為93.8%，特異性為81.1%，符合率為89.2%。結果表明，豬細小病毒血清抗體間接VP2-ELISA檢測方法具有較高的敏感性和特異性，且重復性好，可用于豬細小病毒感染的血清抗體檢測。

豬細小病毒；抗體；VP2-ELISA

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）可引起豬的繁殖障礙，如發情不正常，久配不孕，或產死胎、畸形胎和木乃伊胎，還能引起仔豬的皮炎、腹瀉及關節炎[1]，是造成種豬繁殖障礙疾病的病原之一。豬的繁殖障礙是目前困擾集約化豬場生產的重要問題，為了加強對該病的疫情監測和流行病學調查，有必要建立特異性強、敏感性高的血清學檢測方法。PPV的結構蛋白（St ructural Protein 2，VP2）具有良好的免疫原性，可作為理想的血清學檢測用抗原[2-3]。

筆者以pET32（a）作為表達載體，所選取的片段，盡可能多地涵蓋了VP2的抗原優勢區域，目的蛋白以包涵體形式存在，表達量占菌體蛋白的65.2%，與PPV陽性血清發生特異性反應。本研究運用表達的蛋白作為抗原，通過一系列的條件優化，建立了針對VP2抗體的間接ELISA檢測方法，可用于豬血清中PPV抗體的檢測。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1抗原的制備表達豬細小病毒VP2蛋白的原核表達質粒pET-32a-VP2由中國動物衛生與流行病學中心診斷試劑室構建[4]。經IPTG誘導表達，按照HisBind?Puri f ication Kit說明書純化蛋白，經NanoDrop?ND-1000分光光度計測定蛋白濃度。

1.1.2血清豬細小病毒病（PPV）陽性血清、偽狂犬病（PRV）陽性血清、豬圓環病毒（PCV）陽性血清、豬瘟（HCV）陽性血清、豬日本腦炎（JEV）陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）陽性血清、SPF豬血清（以上血清均由中國動物衛生與流行病學中心診斷試劑室提供）。臨床血清樣品采自國內不同地區豬場的PPV滅活苗免疫豬。

1.1.3主要試劑Ceditest?PPV ELISA Kit為荷蘭賽迪診斷公司產品；兔抗豬IgG-HRP和TMB均為Sigma公司（美國）產品；其他常規試劑均為國產分析純級產品。

1.2方法

1.2.1蛋白含量的測定選擇純化好的抗原，用NanoDrop-1000紫外分光光度計測定蛋白含量，具體方法為：先用2.5μL的純水對儀器進行初始化，再用2.5μL的蛋白洗脫液即含6 M尿素的1×Elution Buf fer做空白調零，最后取2.5μL純化好的蛋白進行測定，測得值即為蛋白濃度。

1.2.2重組抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定采用方陣試驗進行滴定。取96孔酶標板，將純化的VP2重組蛋白用pH 9.6碳酸鹽緩沖液自上而下依次作1:30、1:62.5、1:125、1:250、1:500、1: 1000、1:2000稀釋，100μL/孔；陰陽性血清按1: 12.5、1:25、1:50、1:100、1:200稀釋，加兔抗豬酶標二抗，2%牛血清白蛋白溶液（BSA）為封閉液，進行重組抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的優化。加入100μL/孔TMB，37℃顯色10 min，最后加入100μL/孔終止液終止反應，測OD450值，根據P/N值確定抗原與血清的最佳稀釋度。

1.2.3反應時間的優化采用已優化的抗原包被濃度和血清稀釋度，分別改變包被時間、封閉時間、待檢血清作用時間、酶標二抗稀釋度和作用時間以及底物作用時間，選擇最佳反應條件。

1.2.4特異性試驗利用已建立的間接ELISA檢測方法對PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV陽性血清進行檢測。

1.2.5重復性試驗

1.2.5.1批內重復試驗選取不同OD450值的8份血清樣品，用建立的VP2-ELISA進行8次批內重復檢測。

1.2.5.2批間重復試驗取5份陽性血清樣品，3份陰性血清樣品，分別用3個不同批次包被的酶標板進行檢測。

1.2.6與國外ELISA檢測試劑盒的比較將臨床送檢的102份豬血清樣品分別用建立的VP2-ELISA和國外試劑盒進行平行檢測，比較建立的檢測方法與國外試劑盒檢測結果的敏感性、特異性以及符合率。

2　結果與分析

2.1蛋白濃度測定結果經NanoDrop-1000紫外分光光度計測定，測得VP2蛋白濃度為1.53 mg/mL。

2.2重組抗原的誘導表達及純化如圖1。將重組菌進行超聲裂解后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，結果顯示，在約39.1 KDa處有一條很濃的特異性蛋白條帶，與預期的融合蛋白大小一致，而未經誘導的pET-VP2轉化菌則無此條帶，原始pET-32（a）轉化菌經IPTG誘導后出現約20.4 KDa的6×His蛋白條帶。重組抗原以包涵體形式表達，上清中的蛋白量較少。經His親和層析柱純化后，獲得了純化的重組抗原。

圖1　表達純化產物SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE analysis o f the fusion p rotein

表1　VP2抗原和血清最佳稀釋度的方陣試驗結果Tab le1　Result of the checkerboard titration o f VP2

1:2501:500 1:1000 1:2000 positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N 1.496 0.256 5.844 0.873 0.174 5.017 0.648 0.316 2.051 0.471 0.273 1.725 1.991 0.167 11.922 0.794 0.160 4.963 0.485 0.118 4.110 0.483 0.140 3.450 0.782 0.110 7.109 0.701 0.070 10.014 0.435 0.065 6.692 0.401 0.053 7.566 0.539 0.050 10.780 0.434 0.050 8.68 0.368 0.037 9.946 0.350 0.028 12.500 0.434 0.025 17.360 0.253 0.040 6.325 0.232 0.025 9.28 0.199 0.019 10.474

2.3抗原與血清最佳稀釋度的確定方陣試驗結果（表1）可見，當血清和抗原的稀釋倍數較低時，OD450值都維持在一個較高的水平，但隨著稀釋度達到一定程度時，開始產生明顯的梯度變化。

綜合陰、陽性值、P/N值等方面的因素，初步確定抗原最佳包被濃度為300 ng/孔（即重組抗原以1: 500稀釋），待檢血清以1:50稀釋。

2.4ELISA反應程序通過優化反應條件，建立的ELISA反應程序如下：以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至300 ng/孔，每孔包被100μL，37℃作用2 h后，棄去孔內液體，用PBST洗滌3次，每次5 min；用pH 7.4的10%小牛血清/PBST溶液封閉，200μL/孔，37℃封閉2 h，PBST洗板（方法同前）；用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為樣品稀釋液將待檢血清按1:50稀釋，以100μL/孔加至各孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入1: 25000稀釋的兔抗豬酶標二抗100μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入100μL/孔TMB-過氧化氫尿素溶液，37℃避光顯色10 min后，加入100μL/孔2 M H2SO4終止液終止反應，10 min內在酶標儀上讀取OD450值。檢測時，每塊酶標板上設兩份陽性血清對照、兩份陰性血清對照。計算陽性血清平均值ODP和陰性血清ODN值，陽性血清對照OD450平均值ODP≥0.5，陰性血清對照OD450平均值ODN≤0.2時，試驗成立。待檢血清樣品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判為陽性，反之則判為陰性。

2.5特異性試驗PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV陽性血清用建立的間接VP2-ELISA方法進行檢測，結果均為陰性，表明該方法特異性良好。

2.6重復性試驗

2.6.1批內重復性試驗選取不同OD450值的8份血清樣品，用建立的VP2-ELISA進行8次批內重復檢測，結果見表2，變異系數均低于10%，說明該方法具有良好的批內重復性。

2.6.2批間重復性試驗用建立的VP2-ELISA，取5份陽性血清樣品和3份陰性血清樣品分別用3個不同批次包被的酶標板進行檢測。3次檢測的陰、陽性結果完全一致。5份陽性血清樣品的變異系數分別為5.067%、4.582%、7.573%、4.23%和8.641%，3份陰性血清樣品的變異系數分別為6.714%、5.793%和7.858%，變異系數均低于10%。表明建立的方法具有良好的批間重復性。

表2　VP2-ELISA批內重復性試驗結果Table2　Results of repeat test of VP2-ELISA w ithin a batch

表3　VP2-ELISA與 Ceditest? PPV ELISA檢測結果比較Table3　Results of parallel detection by indirect VP2-ELISA and Ceditest? PPV ELISA

2.7VP2-ELISA方法與Ceditest? PPV ELISA Kit檢測結果比較將102份豬血清樣品分別用建立的間接VP2-ELISA和Ceditest PPV抗體檢測試劑盒進行平行檢測，結果見表3。

由表3可以看出，Ceditest?PPV ELISA Kit檢測為陽性的65份血清樣品中間接VP2-ELISA檢測出61份陽性；Ceditest?PPV ELISA Kit檢測為陰性的37份血清樣品中，間接VP2-ELISA檢出30份陰性。平行檢測的102份血清樣品中兩種方法檢測結果一致的有91份。與Ceditest?PPV ELISA Kit相比，間接VP2-ELISA的敏感性為93.8%，特異性為81.1%，符合率為89.2%。

3　討論與結論

已報道的PPV診斷方法主要有血凝試驗（HA）及血凝抑制試驗（HI）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光技術（IFA）、聚合酶鏈反應（PCR）、核酸探針技術、膠體金標記技術（SECGA）、血清中和試驗（SN）、乳膠凝集試驗（LAT）和免疫電泳技術等。PPV具有血凝性，應用HA試驗檢測病原，是較為快速、簡單的檢測方法[5]，主要用來檢測死產和木乃伊胎兒體內的PPV，但該方法敏感性和特異性不太理想。PCR、核酸探針等診斷技術具有特異性好、靈敏度高的優點，近年來開始廣泛應用于PPV的病原學檢測。HI試驗可用于PPV的血清學檢測，但該方法所需紅細胞為豚鼠紅細胞，且待檢血清的處理也較為繁瑣。ELISA方法特異性好、靈敏度高、快速易行，可實現高通量檢測。國內早有PPV全病毒間接ELISA檢測方法的研究報道[6-8]，但是全病毒抗原因為純度問題容易導致不同程度的背景反應，且病毒純化過程較為繁瑣，難以標準化，還存在潛在散毒的危險[9]。用重組蛋白建立間接ELISA可解決這些問題。

PPV基因組有2個主要的開放閱讀框，包括3’端結構蛋白（核衣殼蛋白）VP1、VP2、VP3以及5’端非結構蛋白NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是構成病毒粒子的主要結構蛋白，具有良好的免疫原性，可以誘導機體產生強烈的免疫應答[10]。李昌文等[11]經過分析表明，不同PPV毒株VP2基因的核苷酸之間的同源性為99%左右，含有細小病毒的保守序列。因此，可選用VP2基因作為檢測豬群感染PPV血清抗體的抗原。國內已有許多學者[12-14]對VP2基因的表達及ELISA檢測方法的建立開展了相關研究，但尚未見與國外商品化PPV ELISA試劑盒檢測結果比較的專題報道。本研究所獲得的VP2重組蛋白，純化后產量高，利用其作為檢測用抗原進行包被，建立了針對VP2抗體的間接ELISA檢測方法，并對反應條件進行了優化。與Ceditest?PPV ELISA Kit檢測結果相比，本方法的敏感性、特異性和符合率分別為93.8%（61/65）、81.1%（30/37）和89.2%（91/102），可用于豬細小病毒病血清抗體的檢測，為豬細小病毒病的防控發揮積極作用。

[1]Mengeling W L,St raw B E,Al laire S D,et al. Porcine parvovirus In Diseases of Swine[M]. 8th Ed.IA:Blackwel l Science/Iowa State University Press,1999,187-200.

[2]Mengeling W L,Lager K M,Vorwald A C,et al. Comparative safety and ef f icacy of at tenuatedsingle-st raninandmul ti-st rainvaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome[J].Vet Microbiol,2003,93(1):25-38.

[3]Anai Ranz,Juan J.Manclus,Esmeralda Diaz-Aroca,et al.Porcine Parvovirus:DNA sequence andgenomeorganization[J].JgenVirol, 1989,70:2541-2553.

[4]周潔，陳義平，楚電峰，等.豬細小病毒結構蛋白VP2主要抗原表位區基因的克隆及原核表達[J].中國動物檢疫，2009，26（2）：42-44.

[5]Joo HS,Donaldson-Wood CR,Johnson RH.Rapid diagnostictechniquesforthedetectionof porcineparvovirusinmummif iedfetuses[J]. Aust ralian Veterinary Journal,1976,52:51-52.

[6]張婉華，葉向陽，徐亞芬.應用ELISA法檢測PPV抗體[J].上海畜牧獸醫通訊，2000，5：10.

[7]劉俊輝，郭福生，龔振華，等.用ELISA檢測豬細小病毒（PPV）血清抗體[J].中國動物檢疫，2004，21（2）：26-27.

[8]卿柳庭.豬細小病毒非結構蛋白NS1和結構蛋白VP2的研究[D].武漢：華中農業大學，2005.

[9]陳義平.豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的高效可溶性表達和檢測血清抗體的間接ELISA方法的建立[D].揚州：揚州大學，2003.

[10]Matinez C,Dalsqaard K,Lopez de Turiso JA, et al.Production of porcine parvovirus emptycapsidswithhighimmunogenicactivity [J].Vaccine 1992,10(10):684-690.

[11]李昌文，仇華吉，吳丹，等.豬細小病毒SY-99株VP2基因的序列分析[J].動物醫學進展，2001，22（1）：44-46.

[12]王金良，沈志強，唐娜，等.豬細小病毒PPV-SD1株VP2全基因原核表達及間接ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫雜志，2008，44（7）：22-24.

[13]陳招娣.豬細小病毒NS1和VP2基因的原核表達及其間接ELISA方法的構建[D].長沙：湖南農業大學，2012.

[14]田莉莉，李林.豬細小病毒VP2蛋白的截短表達與間接ELISA診斷方法的建立[J].畜牧與獸醫，2011，43（11）：59-64.

Establishmentof the IndirectELISA for the Detection of Viralstructuralprotein Antibodies againstPorcine Parvovirus

Zhou Jie1,2,Nan Wenlong2,He Yuanqing1,Yin Lij ing1, Ren Qian1,Qin Lide2,Chen Yiping2*
(1.Laboratory Animal Research Center,Jiangsu University,JiangsuZhenj iang212013; 2.Diagnostic Reagent Laboratory,China Animal Heal th and Epidemic Center,ShandongQingdao266032)

In order to detect porcine parvovirus antibodies,an indirect ELISA was establ ished, by using the recombinant VP2 protein as antigen.The reaction conditions of the VP2-ELISA were explored and optimized.The optimal coating concent ration was 300 ng per wel l,the coating condition was at 4℃overnight,and serum samples were di luted to 1:50.The resul ts showed the VP2-ELISA assay was able to detect PPV positive serum,and had no cross-reactivity with serum against HCV,PRV,PRRSV,JEV and PCV,respectively.The int ra and inter-assay coef f icients of variation(CV)of the VP2-ELISA were al l less than 10%.102 swine serum samples were detected by the VP2-ELISA and Ceditest?PPV ELISA Kit in paral lel.The sensitivity and speci ficity of the VP2-ELISA were 93.8%and 81.1%respectively.The coincidence rate between these two assays was 89.2%.The resul ts indicated that the indirect VP2-ELISA was highly sensitive and speci f ic,and could be used for cl inical detection of PPV antibodies.

Porcine Parvovirus;Antibody;VP2-ELISA

S852.65

B

1672-9692(2016)04-0001-07

2016-03-01

周潔（1984-），女，碩士研究生，主要從事診斷試劑研究和實驗動物相關工作。

陳義平（1966-），男，博士，研究員，主任，主要從事預防獸醫學、診斷試劑研究相關工作。