二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化小米菜色素提取工藝

張一鳴，楊士花，黃佳琦，黃勇樺，李海平，李 淳，李永強(qiáng)

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201;2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院，昆明 650201;3武定縣食品藥品監(jiān)督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南大理白族自治州 672600)

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二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化小米菜色素提取工藝

張一鳴1，楊士花2，黃佳琦1，黃勇樺1，李海平3，李 淳4，李永強(qiáng)1

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201;2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院，昆明 650201;3武定縣食品藥品監(jiān)督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南大理白族自治州 672600)

以小米菜為材料，以吸光度為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)小米菜色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了色素提取效果與提取溫度、液料比、提取時(shí)間的二次回歸數(shù)學(xué)模型，并利用該模型探討了各因素對(duì)色素提取效果的影響。結(jié)果表明：小米菜色素初步定性為復(fù)合色素，可能包含黃酮醇和葉綠素。

小米菜色素；初步定性；二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)；提取工藝優(yōu)化

從生物體中提取的天然色素，相比于合成色素，具有更高的安全性及保健功效，且著色時(shí)色調(diào)更接近天然物質(zhì)顏色[1-8]。小米菜是一種高溫短日照作物[9，10]，因富含多種微量元素及維生素，同時(shí)，小米菜莖、葉內(nèi)色素含量較高，產(chǎn)量高且容易種植，故適于作為天然色素提取原料[9-11]。本研究以小米菜為試驗(yàn)材料，根據(jù)最大吸收波長(zhǎng)和最佳提取溶劑對(duì)小米菜色素進(jìn)行初步定性，利用提取溫度、液料比和提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化小米菜色素的提取工藝，為小米菜色素的開發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米菜，于2015年1月采自墨江，采集后置于4℃?zhèn)溆谩Ｒ掖肌⑹兔训热軇┚鶠榉治黾儭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UV—1800PC型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；XMTD—4000型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA1004A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米菜色素的制備 將小米菜清洗后，稱取一定量的小米菜，研磨，在一定條件下提取3次，過濾，合并濾液，得到小米菜色素溶液。

1.3.2 最大吸收波長(zhǎng)和最佳提取溶劑的確定 通過預(yù)試驗(yàn)，該色素微溶于石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于醇類溶劑，參考相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)該色素可能為黃酮醇化合物[12-14]，故在試驗(yàn)中選擇80%乙醇溶液作為一種提取溶劑。準(zhǔn)確稱取3份2 g樣品置于研缽中，分別加入30 mL蒸餾水、石油醚、80%乙醇溶液，研磨、過濾，分別用不同的提取溶劑定容于50 mL容量瓶中，測(cè)定吸光度，確定該色素的最大吸收波長(zhǎng)和最佳提取溶劑。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 固定反應(yīng)條件為液料比20∶1 (mL/g)、提取溫度40℃，考察不同提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)色素提取效果的影響；固定反應(yīng)條件為提取時(shí)間30 min、提取溫度40℃，考察不同液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)]對(duì)色素提取效果的影響；固定反應(yīng)條件為提取時(shí)間30 min、液料比20∶1mL/g，考察不同提取溫度(20、30、40、50、60℃)對(duì)色素提取效果的影響。以吸光度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)色素提取效果的影響。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取提取溫度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)因素，利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定該色素的最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑和最大吸收波長(zhǎng)的確定

對(duì)以80%乙醇、蒸餾水和石油醚提取的色素溶液在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。因?yàn)槭兔烟崛〉纳厝芤喝芙庑院艿停蕛H將80%乙醇和蒸餾水提取色素溶液進(jìn)行分析。由圖1可以看出，用80%乙醇和水提取的小米菜色素在325、436、669 nm處均有明顯吸收峰，說明該色素易溶于80%的乙醇和蒸餾水，為水溶性色素，且80%乙醇提取液吸收峰高于水提取液，故選取80%乙醇作為提取溶劑。小米菜色素在波長(zhǎng)為325、436、669 nm有3個(gè)吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]可知，325 nm處為黃酮醇類色素特征吸收峰、669 nm處為葉綠素特征吸收峰，故初步定性小米菜色素為復(fù)合色素，可能包含黃酮醇色素和葉綠素。查閱文獻(xiàn)不能根據(jù)最大吸收峰對(duì)436 nm色素進(jìn)行定性，需要利用質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定。本試驗(yàn)對(duì)669 nm波長(zhǎng)的色素不進(jìn)行討論，僅對(duì)325 nm和436 nm波長(zhǎng)下的色素進(jìn)行研究。

圖1 小米菜色素的吸收光譜

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)色素提取效果的影響 由圖2可見，在不同提取溫度下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著提取溫度的上升，色素溶液在2個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在40℃時(shí)達(dá)到最高，吸光度值分別為0.79、0.19。隨著提取溫度的增加，色素分子吸熱后活動(dòng)加快，色素溶出率增加，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過40℃后，色素可能在高溫條件下不穩(wěn)定，導(dǎo)致色素分解，吸光度下降，提取率降低，故選取40℃為提取溫度較適宜。

圖2 提取溫度對(duì)吸光度的影響

2.2.2 液料比對(duì)色素提取效果的影響 由圖3可見，在不同液料比下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著液料比的上升，色素溶液在2個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度均呈逐漸增大趨勢(shì)，液料比大于20∶1 mL/g后，吸光度增大趨勢(shì)不明顯。隨液料比的增加，色素溶出率也增高，在較高的液料比下，色素基本溶出完全，故增加液料比后色素溶液的吸光度變化不再明顯。從減少耗能及提取溶劑用量等方面考慮，選擇20∶1 mL/g的液料比比較理想。

圖3 液料比值對(duì)吸光度的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響 由圖4可見，在不同提取時(shí)間下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，色素溶液在2個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在20 min時(shí)達(dá)到最高，吸光度值分別為0.96、0.52。隨提取時(shí)間的增加，溶出的色素也會(huì)增加，吸光度逐漸變大，到達(dá)一定提取時(shí)間時(shí)，色素基本提取完全，但受光、氧氣等因素影響，色素可能會(huì)發(fā)生分解，導(dǎo)致吸光度下降。故選取提取時(shí)間為20 min較適宜。

圖4 提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.3 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

利用DPS軟件對(duì)表1、表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為：

在325 nm波長(zhǎng)下：Y1=0.575 71+0.126 49X1+0.027 93X2+0.066 69X3-0.040 88X12-0.039 47X22-0.013 83X32-0.004 00X1X2-0.018 00X1X3-0.002 25X2X3

在436 nm波長(zhǎng)下：Y2=1.485 01+0.265 83X1+0.049 06X2+0.155 74X3-0.199 05X12-0.149 37X22-0.141 24X32+0.060 12X1X2+0.060 37X1X3+0.004 12X2X3

根據(jù)表3可知，擬合檢驗(yàn)F2=39.795>F0.01(9，10)=4.95，達(dá)到極顯著水平，失擬檢驗(yàn)F1=4.451

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表4)可知，在436 nm波長(zhǎng)時(shí)，二次回歸模型方程能夠準(zhǔn)確反映提取溫度、液料比和提取時(shí)間與色素吸光度的關(guān)系。

表1 因素水平編碼

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析(325 nm)

表4 方差分析表(436 nm)

2.4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-22]

2.4.1 主因子效應(yīng)分析 根據(jù)回歸方程的偏回歸系數(shù)絕對(duì)值大小斷定在325 nm和436 nm波長(zhǎng)下，回歸方程在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)3種因素對(duì)色素提取效果作用大小依次為：X1(提取溫度)>X3(提取時(shí)間) >X2(液料比)，且全為正效應(yīng)。

2.4.2 單因子效應(yīng)分析 在325 nm波長(zhǎng)下的偏回歸模型中，將3個(gè)因素中的2個(gè)固定在零水平，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行降維分析，得到以其中1個(gè)因素為決定變量的偏回歸模型：

Y1=0.575 71+0.126 49X1-0.040 88X12

(1)

Y2=0.575 71+0.027 93X2-0.039 47X22

(2)

Y3=0.575 71+0.066 69X3-0.013 83X32

(3)

(1)-(3)式，二次項(xiàng)系數(shù)都是負(fù)值，其曲線均是開口向下的拋物線，說明色素的提取率將隨著提取溫度、液料比和提取時(shí)間增加，表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，即這3個(gè)因素均存在最佳值。

在436 nm波長(zhǎng)下的偏回歸模型中，其分析結(jié)果與325 nm波長(zhǎng)下的吸光度的偏回歸模型一致((4)-(6)式)。

Y1=1.485 01+0.265 83X1-0.199 05X12

(4)

Y2=1.485 01+0.049 06X2-0.149 37X22

(5)

Y3=1.485 01+0.155 74X3-0.141 24X32

(6)

2.5 數(shù)學(xué)模型尋優(yōu)[23-27]

2.5.1 變量輪換直接尋優(yōu) 根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.682≤Xi≤1.682 ( i =1，2，3)范圍內(nèi)，對(duì)125個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)。在325 nm波長(zhǎng)下，吸光度最高值0.78，對(duì)應(yīng)各因素取值提取溫度74℃、液料比20∶1 (mL/g)、提取時(shí)間36.8 min。在436 nm波長(zhǎng)下，吸光度最高值1.57，對(duì)應(yīng)各因素取值為提取溫度60℃、液料比20∶1mL/g、提取時(shí)間30 min。

2.5.2 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu) 變量輪換直接尋優(yōu)法沒有考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的隨機(jī)因素，因此，需要用計(jì)算機(jī)對(duì)不同組合進(jìn)行模擬試驗(yàn)。在325 nm波長(zhǎng)下，獲得大于臨界值0.51的方案53個(gè)，由表5可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，吸光度大于0.51的優(yōu)化方案為提取溫度為56.82～64.18℃、液料比為19.41∶1～22.425∶1、提取時(shí)間為21.94～27.94 min。將優(yōu)化方案結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況定為提取溫度為60℃、液料比為20∶1 (mL/g)、提取時(shí)間為25 min。對(duì)此優(yōu)化方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，色素溶液的吸光度為0.50，與優(yōu)化理論值0.51較接近，進(jìn)一步證實(shí)了方案的可靠性。在436 nm波長(zhǎng)下，獲得大于臨界值1.15的方案27個(gè)，由表6可以看出，在95%的置信區(qū)間吸光度大于1.15的優(yōu)化方案為：提取溫度為51.04～61.2℃、液料比為18.55∶1～21.45∶1 mL/g、提取時(shí)間為23.89～30.01 min。將優(yōu)化方案結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況定為：提取溫度為55℃、液料比為20∶1 (mL/g)、提取時(shí)間為27 min。對(duì)此優(yōu)化方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，色素溶液的吸光度為1.14，與優(yōu)化理論值1.15較接近，進(jìn)一步證實(shí)了方案的可靠性。

表5 方案優(yōu)化Xi取值頻率分布(325 nm)

3 結(jié)論

小米菜色素是一種水溶性色素，最佳提取溶劑為80%乙醇溶液，在325、436、669 nm處均有最大吸收峰，初步定性為可能包含黃酮醇色素和葉綠素的復(fù)合色素。最佳提取工藝為：在325 nm波長(zhǎng)下，提取溫度為60℃、液料比為20∶1 mL/g、提取時(shí)間為25 min；在436 nm波長(zhǎng)下，提取溫度為55℃，液料比為20∶1 mL/g、提取時(shí)間為27 min。◇

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(責(zé)任編輯 李燕妮)

Extraction Technology Optimization of Amaranthus paniculatus Pigments by Quadratic General Rotary Design

ZHANG Yi-ming1，YANG Shi-hua2，HUANG Jia-qi1，HUANG Yong-hua1，LI Hai-ping3，LI Chun4，LI Yong-qiang1

(1College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2College of Foreign Languages，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；3WudingCounty’s Food and Drug Administration，Wuding 651600，China;4YongpingCounty’s Food and Drug Testing，Yongping 672600，China)

The preliminary qualitative ofAmaranthusPaniculatusL.pigments using organic solvent method were studied by the comparison of the pigment solubility in different solvents and the maximum absorptions. According to single factor experiment about extraction time，raito of liquid to material and extraction temperature，the extraction technology ofAmaranthusPaniculatusL.pigment was optimized by quadratic general rotary design and a quadratic regression equation was established. Also，effects of the factors were investigated by the equation.Results showed the pigment was one of the complex pigment，may contain flavonoids and chlorophyll.

Amaranthuspaniculatuspigments；preliminary qualitative；Quadratic General Rotary Design； extraction process optimization

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：31360378、31560428)；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013FB042)；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)“國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201410676001、201510676001、201510676007)；云南省教育廳項(xiàng)目：云南省高校食品加工與安全控制重點(diǎn)試驗(yàn)室(項(xiàng)目編號(hào)：201401)。

張一鳴(1993— )，男，碩士，研究方向：功能性食品。

李永強(qiáng)(1975— )，男，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)。