牡蠣肽對小鼠免疫功能影響的研究

陳曉文 ，劉文穎 ，許 丹，朱小語，馮金秋，范愛琴，魯 軍，蔡木易*，許雅君*

(1 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191；2 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院/北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015)

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牡蠣肽對小鼠免疫功能影響的研究

陳曉文1#，劉文穎2#，許 丹1，朱小語1，馮金秋1，范愛琴1，魯 軍2，蔡木易2*，許雅君1*

(1北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191；2中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院/北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015)

目的：研究牡蠣肽對小鼠免疫功能的影響。方法：將牡蠣肽按0.5、1、2g/kgBW配置為不同濃度，ICR雌性小鼠按0.2 mL/10 g BW經(jīng)口灌胃30d后，測定免疫器官重量、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足趾增厚法)、抗體生成細(xì)胞、血清溶血素含量，并鏡觀察胸腺組織形態(tài)。結(jié)果：牡蠣肽可以增加免疫器官相對重量和血清溶血素含量，并能顯著增加抗體生成細(xì)胞和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論：牡蠣肽可在一定程度上增強(qiáng)小鼠免疫功能。

牡蠣肽；免疫調(diào)節(jié)

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展，陸地資源日益不能滿足生產(chǎn)生活的需求，各國逐漸重視挖掘種類豐富、可持續(xù)開發(fā)的海洋資源。海洋生物物質(zhì)由于生長環(huán)境特殊，具有結(jié)構(gòu)特異、活性強(qiáng)、含量低微、毒副作用小等特點(diǎn)[1]。其中海洋生物活性肽及其應(yīng)用取得重大突破和進(jìn)展，海洋肽因其多種生物活性而具有潛在的營養(yǎng)和醫(yī)療價值，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖及心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等[2]。

牡蠣肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，藥食同源，氨基酸組成完善，蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[3]，還含有牛磺酸、不飽和脂肪酸、維生素、及硒、鋅等礦物質(zhì)，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗腫瘤、保肝利腦等諸多作用[4-6]。牡蠣的重要提取物牡蠣肽，具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8，9]、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)[10，11]和促進(jìn)小腸推進(jìn)和消化吸收[12]等功能，而關(guān)于牡蠣肽免疫調(diào)節(jié)作用的報道較少。本研究旨在研究牡蠣肽對健康小鼠的免疫功能的影響，從而更加全面地論證牡蠣肽的免疫調(diào)節(jié)功能，并給臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

牡蠣肽，由中國食品工業(yè)發(fā)酵研究院提供，為淡黃色粉末，是以牡蠣為原料，通過木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶兩步酶解后，再經(jīng)過分離、純化、噴霧干燥等制成的寡肽混合物。分子量在1 000 U以下的肽段占90%以上，主要是八肽以下的小肽。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

ICR雌性小鼠40只，體重18～22 g，在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部購買，合格證號：SCXK(京)2009—0008。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度范圍為22±2 ℃、相對濕度為50%～60%、明暗交替時間為12h：12 h，自由進(jìn)食、飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

SPN3001F電子天平、游標(biāo)卡尺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、CO2培養(yǎng)箱、DNM-9602G酶標(biāo)儀；綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell，SRBC)、補(bǔ)體(豚鼠血清)、Hank’s液、SA緩沖液、瓊脂糖、RPMI1640培養(yǎng)液、都氏試劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，根據(jù)體重分為4組，分別為對照組，牡蠣肽低、中和高劑量組。干預(yù)組在實(shí)驗(yàn)期間按0.2 mL/10 g BW的劑量每天分別給予0.5、1、和2 g/kg BW牡蠣肽灌胃，受試物用滅菌蒸餾水配制，對照組同期給予2 g/kg BW酪蛋白水溶液灌胃，每周稱量體重調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃30 d后測各項(xiàng)免疫指標(biāo)。共計進(jìn)行4個實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)每組各10只動物。各組小鼠自由進(jìn)食、飲水。

免疫指標(biāo)檢測包括：免疫器官臟器指數(shù)及胸腺組織形態(tài)學(xué)觀察；SRBC誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)；抗體生成細(xì)胞檢測；血清溶血素含量測定。具體步驟參照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差進(jìn)行分析。方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，則使用LSD法；若方差不齊，則使用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。P值小于0.05時，認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽對小鼠體重及其免疫器官相對重量的影響

牡蠣肽對小鼠體重?zé)o明顯影響(P>0.05)；與對照組相比，牡蠣肽各劑量組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 牡蠣肽對小鼠體重和免疫器官相對重量的影響

2.2 牡蠣肽對小鼠胸腺發(fā)育的影響

小鼠胸腺HE染色組織切片可見，胸腺分葉清晰，結(jié)構(gòu)正常，皮髓質(zhì)分界明顯，且皮質(zhì)厚，淋巴細(xì)胞密度高，染色深，各劑量組與對照組無明顯差異(附圖)。

附圖 牡蠣肽對小鼠胸腺發(fā)育的影響(HE，100X)

2.3 牡蠣肽對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

牡蠣肽對小鼠遲發(fā)型免疫反應(yīng)的影響，牡蠣肽各劑量組足趾腫脹程度均較對照組高，其中中劑量組和高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 牡蠣肽對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.4 牡蠣肽對小鼠體液免疫的影響

牡蠣肽對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響：牡蠣肽高劑量組較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低、中劑量組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。牡蠣肽對小鼠血清溶血素含量影響：牡蠣肽各組較對照組半數(shù)溶血值有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 牡蠣肽對小鼠體液免疫功能的影響

3 討論

牡蠣作為世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣及其提取物可以抗病毒，增強(qiáng)機(jī)體免疫力也早有報道，Zwe-Ling Kong等[13]發(fā)現(xiàn)，貝類提取物增強(qiáng)細(xì)胞人細(xì)胞系的免疫活性。近年來研究表明，牡蠣多糖是牡蠣促進(jìn)小鼠免疫功能的有效成分[14，15]。Yu-Kai Wang等[9]研究表明，牡蠣蛋白水解物可以促進(jìn)腫瘤小鼠的抗腫瘤，并提高免疫力。

胸腺和脾臟是動物體內(nèi)主要的免疫器官，其中胸腺是T淋巴細(xì)胞分化發(fā)育的主要場所，脾臟則主要負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答，因此它們的結(jié)構(gòu)和功能是否正常對機(jī)體的免疫功能至關(guān)重要[14]。胸腺和脾臟指數(shù)能夠反應(yīng)免疫器官的發(fā)育和免疫細(xì)胞的功能狀況，可以直觀體現(xiàn)機(jī)體非特異性免疫功能狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，牡蠣肽對小鼠正常的生長發(fā)育沒有影響，可增加胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能是因?yàn)槭茉噷ο鬄榻】敌∈螅]有外來抗原刺激，免疫器官不會應(yīng)激性增生，組織HE染色圖片也顯示胸腺結(jié)構(gòu)也無明顯變化。

機(jī)體的特異性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫，遲發(fā)型超敏反應(yīng)又稱Ⅳ型超敏反應(yīng)，是一種有輔助T細(xì)胞(Th)介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。溶血空斑反應(yīng)抗體生成細(xì)胞的數(shù)量，而血清溶血素是淋巴細(xì)胞在接受抗原刺激后分泌的抗體，這兩者是衡量機(jī)體體液免疫的重要指標(biāo)。本研究中，牡蠣肽顯著增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，說明牡蠣肽可以促進(jìn)小鼠的細(xì)胞免疫。在體液免疫功能方面，抗體生成細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)，血清溶血素含量也呈現(xiàn)隨牡蠣肽劑量增加而增加的趨勢，說明牡蠣肽肽可以有效增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。

牡蠣肽作為一種優(yōu)質(zhì)的海產(chǎn)品養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)型貝類，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣肽可以在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫和體液免疫功能，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effect of Oyster Peptide on Immune Function of Mice

CHEN Xiao-wen1#，LIU Wen-ying2#，XU Dan1，ZHU Xiao-yu1，F(xiàn)ENG Jin-qiu1，F(xiàn)AN Ai-qin1，LU Jun2，CAI Mu-yi2*，XU Ya-jun1*

(1Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China；2China National Research Institute of Food and Fermentation Industries/Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100015，China)

【Objective】 To study the effects of oyster peptide on the immunity of mice.【Method】Female ICR mice were administered 0.5，1.0 or 2.0g/kg BW oyster peptide for 4 weeks，and then immune organs weight，cell-mediated immune functions，humoral immune functions and structural changes of thymuses were examined.【Result】 The index of thymus and spleen and content of serum hemolysin increased with oyster peptide intervention.Compared with control group，mice fed with oyster peptide had significantly stronger antibody forming cells and delayed type hypersensitivity(P<0.05).【Conclusion】 Oyster peptides could enhance the immunity of mice.

oyster peptides；immunoregulation

國家十二五科技支撐項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2012BAD33B04-02)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2013AA102205-02)；科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：131110000513026)；北京市科委國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果惠民科技示范工程項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：1311000031130010)。

#并列第一作者：陳曉文(1989— )，男，在讀碩士研究生，研究方向：骨骼發(fā)育與健康；劉文穎(1984—)，女，碩士，研究方向：食源性低聚肽。

*并列通訊作者：許雅君(1976— )，女，教授，研究方向：生命早期營養(yǎng)與疾病；蔡木易(1962— )，男，教授，研究方向：蛋白質(zhì)資源利用、功能肽研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。