食管鱗癌組織中TIM-3、FOXA2表達(dá)與其臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系研究

張 楠 程 多 王晶晶 胡 楊 岳文莉 白慧麗 梁 芳

食管癌為臨床常見消化道惡性腫瘤之一,鱗狀細(xì)胞癌為其主要組織學(xué)類型,約占食管癌患者86.3%,預(yù)后較差[1]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)在機體免疫抑制及周圍免疫耐受中發(fā)揮重要作用,可選擇性表達(dá)于惡性腫瘤組織內(nèi)T細(xì)胞,經(jīng)直接或免疫抑制功能參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移過程[2]。叉頭框蛋白A2(FOXA2)是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,屬于抑癌基因,參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)及代謝調(diào)節(jié)過程,在前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá),且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。基于此,本研究選取87例食管鱗癌患者,擬檢測食管鱗癌組織中TIM-3、FOXA2表達(dá),并探討其與食管鱗癌患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月本院收治的87例食管鱗癌患者(食管鱗癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《食管癌規(guī)范化診治指南》[5]中食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn),接受標(biāo)準(zhǔn)的食管癌根治術(shù)治療,術(shù)后病理確診為鱗狀細(xì)胞癌;②術(shù)前未行放化療或其他生物治療;③對本研究知情同意,簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他惡性腫瘤;②合并認(rèn)知障礙、意識障礙或嚴(yán)重精神系統(tǒng)疾病;③近1年內(nèi)有嚴(yán)重外傷史或出血史;④患有全身免疫系統(tǒng)疾病;⑤妊娠、哺乳期婦女;⑥研究期間因疾病之外其他原因死亡。另選取同期經(jīng)胃鏡活檢診斷為慢性食管炎的50例患者(對照組),排除標(biāo)準(zhǔn)同食管鱗癌組。食管鱗癌組,男性56例,女性31例;年齡38～72歲,平均(60.21±5.48)歲;體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index,BMI)18.25～30.55 kg/m2,平均(23.81±2.84)kg/m2。對照組中,男性32例,女性18例;年齡35～74歲,平均(60.84±7.12)歲;BMI 18.32～30.45 kg/m2,平均(23.76±2.55)kg/m2。兩組患者年齡、性別、BMI等基線資料均衡可比(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 TIM-3、FOXA2表達(dá)檢測 食管鱗癌組術(shù)中切取食管鱗癌組織,對照組胃鏡下留取食管組織。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測TIM-3、FOXA2表達(dá):標(biāo)本組織以石蠟包埋,切片,厚度4 μm,60 ℃烤箱烘烤2 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,加3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS液沖洗。室溫孵育10 min,PBS液沖洗3次,每次5 min。EDTA緩沖液高壓熱力修復(fù)抗原,20 min,PBS液沖洗3次,每次5 min。加兔抗人TIM-3(1∶300)、FOXA2(1∶800)一抗(英國Abcam公司),4 ℃孵育,過夜。加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1000,英國Abcam公司),37 ℃孵育,30 min。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,切片脫水,中性樹膠封片,以PBS液代替一抗作為陰性對照。由2名高級職稱的病理科醫(yī)師采用雙盲法共同閱片,各切片在高倍鏡(×400)下隨機取10個視野,細(xì)胞內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。按照陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)百分率、染色強度計分。陽性細(xì)胞率<10%計1分;10%～50%計2分;>50%計3分。染色強度為無著色計0分;淡黃色計1分;棕黃色計2分;棕褐色計3分。兩者得分相乘,>3分為TIM-3或FOXA2陽性表達(dá),≤3分為陰性表達(dá)。

1.2.2 一般資料收集 收集入組食管鱗癌患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分類、組織學(xué)分級、腫瘤分化程度、浸潤深度及TIM-3、FOXA2表達(dá)等。

1.2.3 預(yù)后評估 食管鱗癌組術(shù)后均按照《食管癌規(guī)范化診治指南》[5]給予規(guī)范化輔助治療,術(shù)后隨訪至2022年1月,隨訪方式包括電話隨訪、微信隨訪、門診隨訪及住院復(fù)查記錄,主要了解患者一般情況、病情變化及預(yù)后。按照預(yù)后隨訪情況分為生存、死亡,其中生存為總體生存,包括有瘤生存和無瘤生存,死亡為因食管鱗癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展或相關(guān)并發(fā)癥死亡。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組TIM-3、FOXA2表達(dá)情況;②比較不同臨床病理特征的食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)情況;③比較不同預(yù)后的食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)情況;④分析TIM-3、FOXA2表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計數(shù)資料采用“例數(shù),率”表示,以χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線,生存檢驗采用Log-rank檢驗;采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析食管鱗癌預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者TIM-3、FOXA2表達(dá)比較

食管鱗癌組TIM-3陽性表達(dá)率高于對照組,FOXA2陽性表達(dá)率低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者TIM-3、FOXA2表達(dá)情況對比(例,%)

2.2 不同臨床病理特征食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)比較

不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同浸潤深度的食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)對比(例,%)

2.3 不同預(yù)后食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)比較

食管鱗癌組87例患者均獲得隨訪,無失訪病例,隨訪時間21～48個月,中位隨訪時間38.5個月。生存68例(78.16%),死亡19例(21.84%)。食管鱗癌組死亡患者TIM-3陽性表達(dá)率高于生存患者,FOXA2陽性表達(dá)率低于生存患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后的食管鱗癌患者TIM-3、FOXA2表達(dá)對比(例,%)

2.4 TIM-3、FOXA2表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示,TIM-3陰性表達(dá)患者總生存率較陽性表達(dá)患者高,Log-rank檢驗χ2=10.325,P<0.001。FOXA2陰性表達(dá)患者總生存率較陽性表達(dá)患者高,Log-rank檢驗χ2=12.845,P<0.001,見圖1。

圖1 TIM-3、FOXA2表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 食管鱗癌預(yù)后的影響因素分析

Cox單因素回歸分析顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TIM-3、FOXA2是影響食管鱗癌患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)。進(jìn)一步行Cox多因素分析顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TIM-3、FOXA2是影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4、表5。

表4 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox單因素回歸分析

表5 食管鱗癌預(yù)后影響因素的Cox多因素回歸分析

3 討論

近年來,世界范圍內(nèi)食管鱗癌相對多發(fā),嚴(yán)重威脅人們生命健康。受食管特殊解剖學(xué)特點影響,食管鱗癌患者更易出現(xiàn)縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,加上早期癥狀不典型,入院確診時已處于中、晚期,喪失最佳治療時機,預(yù)后較差[6]。而且,相較于其他惡性腫瘤,食管鱗癌分子靶向及免疫治療研究較少。因此,臨床深入分析食管鱗癌的分子層面發(fā)病機制,探尋有效分子生物學(xué)標(biāo)志物,以指導(dǎo)早期診斷及預(yù)后評估,為后續(xù)治療提供參考依據(jù),具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示,食管鱗癌組TIM-3陽性表達(dá)率高于對照組,FOXA2陽性表達(dá)率低于對照組;相較于TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T1～T2的食管鱗癌患者,TNM分期Ⅲ～Ⅳ、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T3～T4患者TIM-3陽性表達(dá)率升高,FOXA2陽性表達(dá)率降低(P<0.05),說明食管鱗癌患者存在TIM-3、FOXA2表達(dá)異常,且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度密切相關(guān),這提示TIM-3、FOXA2可能在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為[7],T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。TIM-3為TIM家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于免疫檢查點分子,可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、侵襲及轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)提出[8-9],TIM-3在非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),且與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。楊惠雲(yún)等[10]研究發(fā)現(xiàn),食管鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中TIM-3表達(dá)升高。鄭雨佳等[11]研究也發(fā)現(xiàn),食管癌患者腫瘤組織T細(xì)胞表面存在TIM-3高表達(dá),與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與本研究結(jié)果相符。FOXA2是一種新型抑癌基因,參與維持細(xì)胞增殖及凋亡平衡過程[12]。研究提出[13],FOXA2表達(dá)缺失可增加腫瘤發(fā)生發(fā)展風(fēng)險。段會娟等[14]研究還發(fā)現(xiàn),FOXA2低表達(dá)與肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯密切相關(guān),FOXA2過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。文獻(xiàn)提出[15],食道癌及Barrett食管中FOXA3表達(dá)升高,經(jīng)下凋FOXA3后發(fā)現(xiàn)FOXA2呈低表達(dá),認(rèn)為FOXA3可能經(jīng)由調(diào)控FOXA2,參與食管癌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn),與食管鱗癌生存患者相比,死亡患者TIM-3陽性表達(dá)率升高,FOXA2陽性表達(dá)率降低;Cox多因素回歸分析顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TIM-3、FOXA2為食管鱗癌預(yù)后的獨立影響因素(P<0.05),這提示除TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外,TIM-3、FOXA2也是影響食管鱗癌患者預(yù)后的重要因素。劉凱等[16]研究也證實食管癌組織中TIM-3表達(dá)升高,還發(fā)現(xiàn)TIM-3高表達(dá)可能是影響患者預(yù)后的獨立危險因素,與本研究結(jié)果相符。因此,建議在臨床實踐過程中,加強食管鱗癌患者腫瘤組織TIM-3、FOXA2表達(dá)檢測,以指導(dǎo)治療方案制定,改善預(yù)后。但本研究并未就TIM-3、FOXA2表達(dá)影響食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)機制進(jìn)行分析,今后仍需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述,食管鱗癌組織中存在TIM-3、FOXA2表達(dá)異常,且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及預(yù)后密切相關(guān)。本研究不足之處在于所選病例數(shù)較少,樣本來源有限,均來自同一所醫(yī)院,隨訪時間短,未深入評估遠(yuǎn)期預(yù)后,可能影響結(jié)果客觀性,今后仍需擴大樣本量及樣本來源,延長隨訪時間,進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查研究。