谷胱甘肽對實驗性離體雞小腸上皮細胞氧化應激的干預研究

陳 群，魏炳棟，李 林，于 維，邱玉朗

(吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所，吉林 公主嶺 136100)

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谷胱甘肽對實驗性離體雞小腸上皮細胞氧化應激的干預研究

陳 群，魏炳棟，李 林，于 維，邱玉朗*

(吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所，吉林 公主嶺 136100)

試驗旨在研究氧化應激對動物腸道上皮細胞氧化損傷，以及抗氧化劑對上皮細胞的氧化干預。將培養的雞上皮細胞分為4組，每組設6個重復。對照組A加入等量的三蒸水，試驗組B、C、D分別加入黃嘌呤氧化酶(50 U/L)和黃嘌呤(12 μmol/L)，并在C、D組分別加入谷胱甘肽(1，1.5 μmol/mL)。結果表明：添加黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/X0)導致小腸上皮細胞氧化應激，與對照組比較,顯著降低了小腸上皮細胞(IEC)增殖和抗氧化酶的活性,顯著提高細胞的脂質氧化和凋亡率(P<0.05)。添加不同劑量的谷胱甘肽(GSH)均對IEC的氧化損傷產生保護作用，與B組比較，顯著提高了IEC增殖，降低了細胞的脂質氧化和凋亡率；隨著GSH添加劑量的增加提高了IEC增殖，但C、D組間比較，抗氧化酶活性差異未達顯著水平(P>0.05)。

氧化應激；抗氧化；小腸上皮細胞；谷胱甘肽

消化道是動物體內代謝最為旺盛的系統之一。動物在正常生理情況下，依靠體內抗氧化體系，體內的自由基產生和清除處于動態平衡狀態，保持機體氧化還原狀態平衡。當動物細胞處于內外因素刺激下，機體內產生自由基增多，破壞了機體氧化與抗氧化系統的平衡，導致氧化應激的發生[1]。幼齡動物代謝旺盛，自身氧化還原平衡調節能力較低，更易發生氧化應激。氧化應激的發生導致幼畜消化道發育遲緩和功能下降。具體表現為腸道發育遲緩、功能低下、消化道疾病頻發，尤其是腹瀉發生率較高，加劇了腸道粘膜組織的損傷程度，甚至導致死亡。谷胱甘肽(GSH)是一種由3個氨基酸組成的小肽，是動物體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑。研究自由基對幼齡動物消化道影響機理及干預技術，成為當今熱門研究課題。因此,本試驗建立黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/X0)誘導的雞小腸上皮細胞體外氧化應激模型，研究過量自由基對雛雞小腸上皮細胞內抗氧化能力及細胞增殖的影響，并研究GSH對雛雞小腸上皮細胞氧化損傷的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選未補飼雛雞3只，消毒后迅速處死，剖腹取出小腸，備用于上皮細胞分離。在超凈臺中將剛孵化出的雛雞無菌活體采樣，置于磷酸鹽緩沖液中，清洗小腸組織數次，至上清液清亮。去除腸系膜，用HBSS液清洗，剪成<1 mm3的組織塊，進行上皮細胞分離[2]。用DMEM培養液調細胞數50 000 K/mL，放置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2 試驗設計

上皮細胞培養72 h，鏡檢上皮細胞增殖狀況，篩選貼壁良好的細胞。試驗分為4組，包括對照組和3個試驗組，每組設6個重復，對照組A添加等量的三蒸水，B組加入黃嘌呤(12 μmol/L)和黃嘌呤氧化酶(50 U/L)，C、D組加入黃嘌呤(12 μmol/L)和黃嘌呤氧化酶(50 U/L)，然后再分別加入谷胱甘肽(1，1.5 μmol/mL)。

1.3 上皮細胞增值測定

在上皮細胞氧化應激2和36 h后，重新更換DMEM培養液。采用噻唑藍比色法測定上皮細胞增殖，在酶聯免疫檢測儀上492 nm處測光吸收度。

1.4 丙二醛(MDA)含量測定

在應激后2和36 h分別測定細胞培養液和上皮細胞中的MDA濃度，在4 ℃，2 000 g離心5 min，取上清液，進行細胞培養液中MDA含量測定。用三蒸水稀釋細胞至濃度為5×106cfu/mL，采用超聲波對培養細胞進行破碎，2 500 g離心10 min，收集裂解后的上清液。進行MDA含量測定，試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.5 抗氧化酶活性測定

上皮細胞培養36 h后，去除培養液，采用磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)反復漂洗上皮細胞3次，采用反復凍融法裂解上皮細胞，采用試劑盒進行過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.6 細胞凋亡率測定

利用0.25%的胰酶消化貼壁培養的細胞。200 g離心10 min收集細胞，棄去上清，磷酸鹽緩沖液漂洗1次，將細胞重懸于預冷的70%乙醇，在4 ℃條件下固定1 h。PBS洗滌1次，200 g離心10 min，進行細胞的收集，并在4 ℃避光染色30 min。將經PI染色細胞懸液用300目的尼龍膜過濾后，利用流式細胞儀進行凋亡細胞定量測定。

1.7 數據處理

試驗數據采用SPSS 16.0統計軟件進行方差分析，進行Duncan氏分析比較其差異顯著性，以P<0.05作為檢驗數據差異顯著水平，統計的結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞增殖的影響

谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞增殖的影響見圖1。

圖1 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞增殖的影響

添加X/XO明顯降低了上皮細胞的增殖，單獨添加X/XO的B組細胞增殖數量顯著低于其他各組(P<0.05)。與B組比較，添加GSH顯著提高了細胞增殖數量，且隨GSH添加劑量的增加而增長，但C、D 2組間差異未達顯著水平(P>0.05)。

2.2 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞抗氧化能力的影響

由表1可知，過量的自由基降低了抗氧化酶活性，在36 h，B組細胞內SOD和CAT的酶活顯著下降，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。與XO單獨處理組比較，添加GSH提高了SOD和CAT酶的活性(P>0.05)，抗氧化酶活性隨GSH 的劑量增加呈遞增趨勢。添加不同劑量的GSH 2組之間抗氧化酶活性差異未達顯著水平(P>0.05)。

表1 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞抗氧化能力的影響

2.3 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞MDA含量的影響

由表2可知，在應激2和36 h 2個時相點，與對照組比較，添加XO應激組顯著提高了小腸上皮細胞和培養液中MDA的產量(P<0.05)。添加GSH降低了MDA產量，與應激組比較，在2 h時相點，顯著降低了培養液中MDA的產量(P<0.05)，在36 h時相點，顯著降低了小腸上皮細胞和培養液中MDA的產量(P<0.05)。在36 h時相點與對照組比較，添加1.5 μmol/mL GSH的小腸上皮細胞中MDA的含量無顯著差異(P>0.05)。添加不同劑量的GSH試驗組之間，在2 h時相點，培養液中MDA的含量差異不顯著。

表2 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞中MDA含量的影響

2.4 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞凋亡率的影響

谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞凋亡率的影響見圖2。

由圖2可知，應激處理后36 h，X/XO處理的細胞凋亡率顯著高于其他各組，與X/XO單獨處理組比較，添加GSH均顯著降低了細胞的凋亡率(P<0.05)；添加不同水平的GSH抑制了培養細胞的凋亡，而且隨著GSH添加劑量的增加而抑制效果明顯，添加不同劑量的GSH兩個處理組間也差異達顯著水平(P<0.05)。

圖2 谷胱甘肽對氧化應激上皮細胞凋亡率的影響

3 討論

3.1 對小腸上皮細胞增殖的影響

本試驗建立的氧化應激模型模擬了腸道產生自由基來源，避免了動物體內試驗條件下多種因素的影響。在XO作用下IECs增殖明顯低于對照組，證明氧化應激抑制了IECs的增殖和細胞代謝的活動性。Nilsson等(1994)發現，再灌注導致自由基顯著提高，同時GSH含量降低少，而次黃嘌呤減少，尿酸增加[3]。

GSH是細胞內巰基含量最高的低分子多肽，對機體維持氧化還原狀態發揮重要作用[4,5]。其通過清除自由基來增強機體免疫能力，增強機體防御多種疾病，減少H2O2等毒素的氧化損傷[6,7]。目前許多研究證實正常小腸細胞的增殖、分化與細胞內還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽和細胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原系統的氧化還原電位密切相關[8]。還原型谷胱甘肽是體細胞內的主要代謝調節物質，對細胞有多種生化作用，能清除體內多種氧自由基，具有保護細胞膜的完整性和解毒等作用。本試驗中GSH顯著提高了離體小腸上皮細胞的增殖，可能是固有層細胞外環境還原降低，促進固有層T淋巴細胞活化，提高細胞增殖，而細胞內GSH的減少是固有層T淋巴細胞增殖減少的重要因素。

3.2 對上皮細胞中SOD和CAT活性的影響

維持細胞內氧化還原狀態平衡及自由基適度水平對維持細胞功能有著重要作用，當自由基數量超出生物體自身抗氧化能力時導致氧化應激。張蓉等(2009)證實，高脂日糧造成小鼠機體活性氧水平升高，抗氧化能力顯著下降，同時腸道菌群失衡，大腸桿菌增多，乳桿菌減少[9]。本試驗中，XO處理組顯著降低了細胞內SOD和CAT的酶活，過量自由基的產生降低了抗氧化酶的活性。氧化應激導致機體自由基產生量增加,而機體內抗氧化系統的活性也提高,隨著應激時間的延長,氧化應激仍然造成細胞破壞,組織損傷[10,11]。冷應激使小鼠腦組織SOD活性下降[12]。機體的氧化還原系統保持著動態平衡，SOD和GSH-Px等通過清除自由基對維持機體平衡發揮著重要作用，保護機體組織細胞免受損傷[13]。在應激條件下，抗氧化物活性的提高可能是由于機體的自身保護代償機制，使清除超氧陰離子的能力增強。本試驗中，GSH抑制了XO導致的抗氧化酶活性的降低，表明GSH提高了離體細胞抗氧化能力。添加GSH增加了SOD和CAT酶的活性，主要是通過GSH清除H2O2，降低H2O2鈍化抗氧化酶的能力，由谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSH/GSSG)組成腸腔的氧化還原狀態，更好的維持腸黏膜完整性。

3.3 對上皮細胞培養液和細胞內容物中MDA含量的影響

MDA是動物體內主要的脂質過氧化產物，測定MDA的濃度可反映體內的氧化還原狀態，其濃度提高被認為是自由基通過脂質過氧化誘發的，氧自由基引起細胞膜內的脂質和血漿脂質氧化，因此可間接表明體細胞受損傷的程度，并作為毒理學的評價指標[14-16]，本試驗發現在2 h和36 h，X/XO處理均顯著提高了細胞內游離的MDA含量，而且隨著培養時間增加，培養細胞脂質氧化程度越高。因此，證實細胞膜和細胞內膜均受到了自由基的攻擊。慢性應激誘發大鼠腦組織中脂質過氧化加劇，腦組織中MDA濃度顯著提高氧自由基生成增加[17]。氧化應激引起小鼠小腸旁細胞滲透性提高，活性氧起著重要作用[18]。與單獨應激處理組比較，添加GSH后的2個時相點細胞內MDA均明顯下降，主要原因是GSH能夠把H2O2還原為H2O，自身被氧化為GSSG。GSH通過減少H2O2數量，減輕了自由基對細胞的氧化損傷。

3.4 對上皮細胞凋亡率的影響

在正常生理條件下，細胞活性取決于線粒體內氧化還原狀態的平衡。代謝過程使細胞始終處于自由基的氧化攻擊狀態，大量研究發現，許多誘發細胞程序死亡的試劑是氧化劑,其可能是細胞程序死亡的主要介質。通過提高氧化劑可以使凋亡的誘導因子活化，增強誘導凋亡的活性[19]。細胞內抗氧化物和自由基失衡，就會導致細胞死亡和器官損傷。氧化應激導致大量自由基耗盡抗氧化物導致細胞凋亡。朱麗慧(2014)發現，斷奶仔豬腸細胞凋亡的增加與仔豬抗氧化能力的降低和自由基產生增加顯著相關[20]。通過細胞信號傳導途徑氧自由基可以對細胞的增殖、凋亡產生影響，其通過影響黏膜細胞的基因表達，調節腸道的功能。氧化應激產物MDA可促進刺激Ca2+從內質網和線粒體釋放。Ca2+濃度的增加可激活導致細胞凋亡的多個各個信號轉導途徑[21]。楊瑞麗等(2008)證實，高脂日糧可使小鼠肝臟基因表達195個顯著下調，135個顯著上調[22]。氧化應激誘導細胞凋亡的原因，可能是導致細胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇脂質過氧化有關。誘導細胞凋亡的因子種類很多，有些能夠誘發自由基形成，間接地使部分敏感細胞氧化損傷。自由基引起的氧化應激誘導的DNA損傷超過了動物機體細胞自我修復的能力，將會對動物機體造成各種損傷，甚至凋亡[23]。

細胞內GSH貯存與氧化應激造成的前期細胞凋亡相關[24]。該試驗發現，添加GSH顯著降低了上皮細胞的凋亡率，可能與GSH一定程度上緩減氧化應激、提高細胞抗氧化能力、保護腸細胞結構的完整性有關。

4 結論

X/XO系統導致離體雛雞IEC的增殖明顯降低，細胞膜氧化脂質化和細胞凋亡率明顯提高。外源性GSH能夠有效抑制誘發性氧化應激對IEC造成的氧化損傷，抑制能力隨著GSH添加劑量的增加而提高。

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Intervention effect of glutathione against oxidative injury in intestinal epithelial cells of chicken in vitro

CHEN Qun, WEI Bingdong, LI Lin, YU Wei, QIU Yulang*

(InstituteofAnimalNutritionandFeed,JilinAcademyofAgriculturalSciences,GongzhulingJilin136100,China)

To study the injury effect of oxidative stress on intestinal epithelial cells (IECs) of chicken and antioxidative action of glutathione(GSH)in vitro. IECs were randomly assigned to four groups with six replicates per group, B, C, D groups were added xanthine (12 μmol/L) and xanthine oxidase (50 U/L), C, D groups were adde-d GSH (1, 1.5 μmol/mL), respectively. The results showed that X/XO supplementation significantly inhibited the proliferation of IECs and the activities of catalase (CAT) and super oxide dismutase (SOD), increased the lipid peroxidation and the apoptosis of IECs compared with the control group (P<0.05). Presence of GSH could protect from oxidative injury of IECs in vitro, remarkably enhanced the proliferation of IECs, and decreased the lipid peroxidation and the apoptosis of IECs in a dose-dependent manner compared with X/XO alone-group (P<0.05). However, there were no significant differences in proliferation and activity of antioxidant enzyme between groups C and D (P>0.05).

oxidative stress; antioxidation; intestinal epithelial cells; glutathione

2016-07-25 基金項目：吉林省科技廳自然基金重點項目(20140101024JC)

陳群(1968—)，男，山東莒縣人，研究員，博士，研究方向為動物營養調控與生物飼料研究。邱玉朗為通信作者，

E-mail: qiuyulang2002@163.com

1004-7999(2016)03-0251-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.013

R96

A