黑參對(duì)昆明種小鼠的抗疲勞作用研究

史得君，黃柏申，崔清美，齊欣，陳兆雙，崔承弼1,*

(1.延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院：吉林 延吉 133002；3.長(zhǎng)白山科學(xué)研究院，吉林 安圖 133600)

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黑參對(duì)昆明種小鼠的抗疲勞作用研究

史得君1，2，黃柏申2，崔清美2，齊欣2，陳兆雙3*，崔承弼1,2*

(1.延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院：吉林 延吉 133002；3.長(zhǎng)白山科學(xué)研究院，吉林 安圖 133600)

試驗(yàn)研究了黑參對(duì)昆明種雄性小鼠的抗疲勞作用。通過將粉碎黑參溶解于蒸餾水制成3種濃度的懸濁液，對(duì)對(duì)照組及黑參處理高、中、低劑量組雄性昆明種小鼠進(jìn)行2周連續(xù)灌胃，對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水,同時(shí)記錄各組小鼠體重的變化，試驗(yàn)階段結(jié)束后檢測(cè)小鼠爬桿時(shí)間，力竭游泳時(shí)間，檢測(cè)肝糖原、血乳酸(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)的變化。結(jié)果表明：在高、中、低3劑量組對(duì)小鼠體重沒有顯著影響的前提下，中、高2劑量組顯著延長(zhǎng)了其爬桿時(shí)間，力竭游泳時(shí)間，增加了小鼠肝糖原含量，增強(qiáng)了乳酸脫氫酶的活性，同時(shí)減少了血乳酸含量，對(duì)昆明種雄性小鼠產(chǎn)生了顯著的抗疲勞效果；試驗(yàn)由此證明了黑參對(duì)昆明種小鼠具有抗疲勞作用，為黑參抗疲勞產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。

黑參；抗疲勞；肝糖原；乳酸；乳酸脫氫酶

人參為五加科植物(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中醫(yī)藥學(xué)者們最為關(guān)注的補(bǔ)身佳品，有復(fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智之效[1]。我國(guó)人參主要分布于黑龍江東部、吉林東半部和遼寧東部地區(qū);國(guó)外人參主要分布區(qū)俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，韓國(guó)狼林、赴戰(zhàn)嶺、白頭山脈，日本也有栽培。吉林省是亞洲乃至世界的主要人參產(chǎn)區(qū)之一[2]，其人參產(chǎn)量占全國(guó)的85%和全世界的63%。“吉林長(zhǎng)白山人參”已被列為我國(guó)原產(chǎn)地區(qū)地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)物[3]。現(xiàn)代藥理研究顯示，人參包含多種化學(xué)因子，主要有人參皂苷、參多糖、多肽、脂肪酸、氨基酸、人參黃酮類等[4]。而人參中最有效、應(yīng)用最廣泛的活性物質(zhì)是人參皂苷。如今，人參已被發(fā)現(xiàn)擁有多種生物活性，如抗壓，抗氧化，改善內(nèi)分泌系統(tǒng)，提升免疫系統(tǒng)等的保護(hù)作用以及紅參等人參制品對(duì)機(jī)體的抗炎癥、抗疲勞作用和對(duì)脂肪肝等疾病的改善和治療作用等[5-7]，依據(jù)藥理研究、臨床觀測(cè)和流行病學(xué)的調(diào)查，均發(fā)現(xiàn)人參擁有改進(jìn)微循環(huán)，增強(qiáng)組織抗缺氧的能力，其最大的特點(diǎn)用一句話來概括就是“多服久服不傷身、輕身益氣不老延年”[8]。

黑參是一種新型的人參加工品，是通過韓國(guó)的傳統(tǒng)方法九蒸九曝原理進(jìn)行炮制的。九蒸九曝，即使藥材通過反復(fù)蒸制來進(jìn)行加工，蒸為陰，曝為陽(yáng)，反復(fù)進(jìn)行，每次蒸曝都會(huì)使藥材的藥性發(fā)生變化，并通過陰陽(yáng)提煉發(fā)揮出最大的作用，也可增加藥材的藥物成分，使藥材能更好的發(fā)揮功效。在炮制過程中，藥材成分發(fā)生變化，大分子皂苷降解，產(chǎn)生不同的皂苷成分，也是黑參與白參、紅參活性不同的原因[9-10]。

疲勞是人體的一種非常復(fù)雜的生理狀態(tài)，一般分為精神疲勞、肌肉疲勞和內(nèi)臟疲勞等3類，其中，內(nèi)臟疲勞多是由肌肉疲勞引起的，而精神和肌肉疲勞直接導(dǎo)致的就是工作能力及工作效率的降低[11]。因?yàn)槠跈C(jī)制的不確實(shí)性和復(fù)雜性，目前還沒有確切的藥物治療方法和顯著的效果，而利用中藥對(duì)抗疲勞進(jìn)行治療，能夠加強(qiáng)機(jī)體的功能，具有巨大的潛力。

黑參身為繼白參、紅參以后出現(xiàn)的新型人參產(chǎn)品，加工方法和藥理活性研究主要集中在韓國(guó)專利上，所以國(guó)內(nèi)關(guān)于黑參抗疲勞功效的研究還不夠深入。通過本次試驗(yàn)，會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)黑參抗疲勞功效的認(rèn)識(shí)，也有助于黑參保健食品的綜合開發(fā)利用和國(guó)內(nèi)黑參市場(chǎng)的開拓。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼育條件

昆明種雄性小鼠20只，4周齡，體重18～22 g，由延邊大學(xué)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于延邊大學(xué)食品研究中心動(dòng)物室，室溫(24±2) ℃，相對(duì)濕度(55±10)%，試驗(yàn)于2016年3～5月進(jìn)行。試驗(yàn)前小鼠適應(yīng)7 d，試驗(yàn)過程中能自由攝食和飲水。

1.2 試劑、材料及主要儀器

1) 試劑 95%乙醇(AR)，0.9%生理鹽水(AR)，葡萄糖(AR)，98%濃硫酸(AR)。

2) 材料 黑參(琿春旭竹貿(mào)易有限公司)。

3) 儀器 糖原測(cè)試盒(貨號(hào)：A043,購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；乳酸(LD)測(cè)試盒(貨號(hào)：A019-2,南京建成生物工程研究所)；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(貨號(hào)：A020-,南京建成生物工程研究所)；SB-10A 多功能粉碎機(jī)(上海浦恒信息科技有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；U-3900分光光度計(jì)(日立儀器有限公司)；8O-2高速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；TG16A-WS離心機(jī)(上海盧湘儀器有限公司)；FA2004分析天平(上海上平儀器有限公司)。

1.3 黑參懸濁液的制備

將干黑參500 g于粉碎機(jī)中粉碎，過200目篩，反復(fù)3次。將黑參干粉溶于蒸餾水中，濃度梯度為低濃度0.141 6 g/mL,中濃度0.248 1 g/mL,高濃度0.331 1 g/mL，定容體積均為50 mL,待用，懸濁液稱黑參干粉懸濁液(Black Ginseng Powder Suspension)，以下均稱BGPS。

1.4 方法

1.4.1 基本流程

20只小鼠隨機(jī)分為4組，每組各5只。將灌胃量分為3個(gè)梯度即低濃度為1.65 g/kg b.w.,中濃度為3.30 g/kg b.w.,高濃度為4.95 g/kg b.w.，對(duì)照組灌胃等量蒸餾水，灌胃前搖勻懸濁液。每3 d 稱重1次1周記錄1次，每天察看小鼠的飲食、精神、被毛和大小便等狀態(tài)[12-13]。持續(xù)灌胃2周后，測(cè)定各項(xiàng)抗疲勞生理生化指標(biāo)。小鼠的灌胃體積為0.1 mL/10 g b.w.，探究黑參是否有抗疲勞功效。

1.4.2 BGPS對(duì)小鼠爬桿時(shí)間的影響

每組5只小鼠，第2周給藥30 min后，放于有機(jī)玻璃桿上[試驗(yàn)時(shí)將爬桿架放入深30 cm、水溫(25±2) ℃的深桶中]，使小鼠肌肉處在靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠從放入爬竿到肌肉疲勞從有機(jī)桿上落下來的時(shí)間，第3次落水時(shí)停止試驗(yàn)，累計(jì)3次的時(shí)間作為爬桿時(shí)間[14]。

1.4.3 BGPS對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

小鼠休息1 d，每只鼠尾上系以自身重量10%的重物，放入水深約30 cm、水溫(25±2) ℃的水箱中進(jìn)行游泳試驗(yàn)。記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間，記為小鼠游泳時(shí)間[15-17]，力竭標(biāo)準(zhǔn)為小鼠的嘴和鼻子保持在水面下 8 s 不抬頭，則可判定小鼠力竭[18-19]。

1.4.4 BGPS對(duì)小鼠體重的影響

計(jì)算各劑量組小鼠體重的變化，做出標(biāo)準(zhǔn)偏差并進(jìn)行顯著性差異分析。

1.4.5 小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的測(cè)定

小鼠恢復(fù)24 h，負(fù)重游泳30 min，休息30 min后，摘眼球取血處死，血液立刻冷藏于4 ℃冰箱。解剖取小鼠肝臟，用生理鹽水浸泡去除血液，并去除多余脂肪組織，用濾紙吸干后稱量剪取，放入-20 ℃ 冰箱保存，嚴(yán)格按照試劑盒方法測(cè)量肝糖原儲(chǔ)備量[20]。

1.4.6 小鼠血乳酸含量的測(cè)定

將得到的血液以3 000 r/min離心15 min,取上層血清，-20 ℃ 保存。測(cè)量前按照試劑盒方法，將6 mol/L的乳酸標(biāo)準(zhǔn)液用雙蒸水稀釋成梯度濃度為6、5、4、3、2、1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，530 nm波長(zhǎng)于分光光度計(jì)下檢測(cè)溶液光密度并繪制LD標(biāo)準(zhǔn)曲線，以小鼠血清中OD值測(cè)定其血清乳酸含量[20]。

1.4.7 小鼠乳酸脫氫酶活性的測(cè)定

將血液以3 000 r/min離心7 min。取上層血清，放入-20 ℃保存。測(cè)量前按照試劑盒方法取10 μL LHD標(biāo)準(zhǔn)液定容至10 mL，并在440 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，進(jìn)行血清中乳酸脫氫酶活性的測(cè)量[20]。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

各表分析結(jié)果均經(jīng)由SPSS 19.0軟件進(jìn)行，為與對(duì)照組進(jìn)行的樣本配對(duì)T檢驗(yàn)。

2.1 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)狀態(tài)的影響

經(jīng)過2周試驗(yàn)及小鼠生理狀態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)各組小鼠在試驗(yàn)過程中精力隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)越來越旺盛，被毛更光滑，飲食和大小便情況均無異常。

2.2 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠重量的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠重量的影響見表1。

表1 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠體重的影響

由表1可知，對(duì)昆明種小鼠連續(xù)灌胃2周后，各試驗(yàn)組小鼠的體重都呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且趨勢(shì)相近。分析比較結(jié)果表明：各試驗(yàn)組小鼠組內(nèi)和同一時(shí)間組間體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明小鼠身體狀況相當(dāng)。試驗(yàn)系統(tǒng)誤差小，且BGPS低、中、高劑量組均對(duì)小鼠體重影響不大。

2.3 BGPS對(duì)小鼠爬桿時(shí)間的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠爬桿時(shí)間的影響見表2。

表2 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠爬桿時(shí)間的影響

注:與對(duì)照組相比,**表示P<0.01，***表示P<0.001,下同。

由表2可知，BGPS中，高劑量組延長(zhǎng)了小鼠的爬桿時(shí)間，低劑量組與對(duì)照組相比效果不明顯。分析比較結(jié)果表明：中、高劑量組明顯延長(zhǎng)了小鼠的爬桿時(shí)間，低劑量組小鼠爬桿時(shí)間與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01)，高劑量組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.000 1)。

2.4 BGPS對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響見表3。

表3 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響(X±SD)

由表3可知，BGPS中、高劑量組顯著提高了小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間。分析比較結(jié)果表明：中、高劑量組與對(duì)照組相比明顯提高了小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，中、高劑量組對(duì)延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間有極顯著效果(P<0.001)。

2.5 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響見表4。

表4 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠肝糖儲(chǔ)備量量的影響

由表4可知,BGPS中、高劑量組顯著增加了小鼠的肝糖原的儲(chǔ)備量。分析比較結(jié)果表明,中、高劑量組明顯增加了小鼠肝糖原儲(chǔ)備量，高劑量組與對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.01)；中劑量組與對(duì)照組之間差異極顯著(P<0.001)，而低劑量組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠血液中乳酸含量的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠血液中乳酸含量的影響見表5。

表5 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠血液中乳酸含量的影響

由表5可知,BGPS中、高劑量組顯著減少了小鼠血液中乳酸的含量。分析結(jié)果表明：中、高藥物劑量組顯著降低了小鼠血液中乳酸的含量，其中，高劑量組與對(duì)照組均有顯著性差異(P<0.01)，而中劑量組與對(duì)照組相比有極顯著差異(P<0.001)，低劑量組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 BGPS對(duì)試驗(yàn)組小鼠血液乳酸脫氫酶活性的影響

BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠血液中脫氫酶活性的影響見表6。

表6 BGPS對(duì)各試驗(yàn)組小鼠血液中脫氫酶活性的影響

由表6可知,BGPS中、高劑量組顯著增強(qiáng)了小鼠血液中乳酸脫氫酶的活性。分析結(jié)果表明：中、高劑量組能提高小鼠血乳酸脫氫酶的活性，其中,高劑量組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01)；中劑量組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明,黑參能明顯提高小鼠爬桿時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間，從而加強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力；能顯著提升小鼠肝糖原的儲(chǔ)備量,降低小鼠血液中乳酸的濃度,同時(shí)增強(qiáng)小鼠血液中乳酸脫氫酶的活性，最終延緩疲勞產(chǎn)生，達(dá)到抗疲勞效果，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力，與其他人參制品的相關(guān)研究比較可以發(fā)現(xiàn),黑參具有一定的優(yōu)勢(shì)。

黑參興起于韓國(guó)，是由傳統(tǒng)韓藥材加工方式將鮮人參經(jīng)過“九蒸九曝”加工得到的呈淡褐色或黑茶褐色的人參產(chǎn)品[10]。試驗(yàn)結(jié)果表明,其能夠作為開發(fā)抗疲勞類保健食品的原材料。在國(guó)內(nèi)功能性食品行業(yè)蓬勃發(fā)展的今天，人們?cè)絹碓街匾暠＝∑返膶?shí)際功效，但事實(shí)上其品質(zhì)卻難以保證，根據(jù)顏偉華等在對(duì)市場(chǎng)上已有抗疲勞保健食品的篩查發(fā)現(xiàn)了疑似非法添加的西地那非等違禁成分[21]，這讓消費(fèi)者對(duì)原本稀缺的抗疲勞產(chǎn)品也無法保持從容接受的心態(tài)。黑參作為新興的人參加工品，由于其獨(dú)特的加工工藝對(duì)其有效成分的積極影響而擁有著巨大的開發(fā)潛力，所以以黑參為基礎(chǔ)來拓展功能性食品市場(chǎng)將會(huì)有一定的前景。

疲勞是由機(jī)體運(yùn)動(dòng)本身所引起的“機(jī)體生理過程不能持續(xù)其功能在特定水平和/或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降的現(xiàn)象[22]。隨著研究的逐漸深入，趙遠(yuǎn)等發(fā)現(xiàn)，持續(xù)15 d以4.96 g/kg或1.65 g/kg的生曬參或紅參干粉混懸液灌胃，能明顯延長(zhǎng)負(fù)重小鼠的游泳時(shí)間[23]，而本試驗(yàn)采用相似的劑量對(duì)黑參的抗疲勞功效進(jìn)行探索的結(jié)果也表明,黑參懸濁液中、高劑量組對(duì)延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間效果顯著。雷海容等研究的富肽奶粉對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞抵抗效果的結(jié)果顯示，其高劑量組延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間達(dá)到3.3 min，這對(duì)試驗(yàn)有一定的比較借鑒意義，反映了試驗(yàn)抗疲勞效果的有效性[24]。

糖原是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的主要能源物質(zhì)，能以無氧酵解和有氧代謝2種方式產(chǎn)生ATP為機(jī)體供能。試驗(yàn)結(jié)果顯示,黑參顯著增加了肝糖原的儲(chǔ)備量，能在運(yùn)動(dòng)過程中維持血糖水平穩(wěn)定，通過及時(shí)為身體提供能量來起到抗疲勞的作用，這一點(diǎn)與吳濤采用蘆丁進(jìn)行的抗疲勞試驗(yàn)的結(jié)果相似[25-26]。

乳酸是碳水化合物無氧糖酵解的產(chǎn)物[27]。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，葡萄糖劇烈厭氧分解產(chǎn)生大量乳酸，影響身體的正常代謝，致使運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生。而羅麗華等人采用復(fù)方功能制劑進(jìn)行的抗疲勞研究結(jié)果與黑參的抗疲勞研究結(jié)果如出一轍，都可以顯著減少乳酸的堆積，恢復(fù)被乳酸破壞的機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，讓機(jī)體能重新恢復(fù)正常代謝。

乳酸脫氫酶可以加速乳酸代謝，防止乳酸在體內(nèi)聚集[28]。所以乳酸脫氫酶的活性對(duì)衡量抗疲勞作用尤為重要。相似的，高偉博在進(jìn)行同樣采用昆明種雄性小鼠進(jìn)行15 d動(dòng)物試驗(yàn)后，結(jié)果顯示,人參、紅參、高壓紅參對(duì)小鼠肝糖原、血乳酸及乳酸脫氫酶的活性均有有益作用，具有抗疲勞作用，其中尤其以人參的抗疲勞效果最為顯著，與黑參抗疲勞效果相似但不如后者，邵繼萍在以丹參提取物喂養(yǎng)小鼠對(duì)其持續(xù)性訓(xùn)練后骨骼肌進(jìn)行抗疲勞作用評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示,抗疲勞效果隨丹參提取物劑量的下降呈降低趨勢(shì)，但低劑量仍高于對(duì)照組,具有顯著抗疲勞效果，表現(xiàn)為提升了乳酸脫氫酶的活性[29]。

綜上所述，黑參對(duì)于昆明種雄性小鼠在抗疲勞方面有著顯著作用，為今后以黑參為原材料開發(fā)抗疲勞類保健食品提供了研究依據(jù)，也為國(guó)內(nèi)人參的加工提供了參考。

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Anti-fatigue effect of Black Ginseng on KM mice

SHI Dejun1,2，HUANG Baishen2，CUI Qingmei2，QI Xin2，CHEN Zhaoshuang3*，CUI Chengbi1,2*

(1.KeyLaboratoryofNaturalResourceofChangbaiMountainandFunctionalMolecular,MinistryofEducation,YanbianUniversity；2.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity：YanjiJilin133002,China;3.ChangbaiMountainSciencesResearchInstitute,AntuJilin133600,China)

The anti-fatigue effect of Black Ginseng on male KM mice was studied. Black Ginseng samples were crushed into powder and dissolved in distilled water as suspension for three concentrations. The mice were intragastrically given with different doses Black Ginseng powder suspension in high, medium and low dose groups, the control group is given equal volume of distilled water. The weight change, pole-climbing time, swimming time, the content of liver glycogen, blood lactic acid (LD) and the activity of lactate dehydrogenase( LDH) of mice were measured; The results showed that there is no significant effect the dose group had on body weight in mice, the pole-climbing, swimming time significantly extended in the two high-dose groups, the content of liver glycogen increased and the activity of lactate dehydrogenase enhanced, the blood lactic acid reduced in mice. The experiment proved that Black Ginseng has significant anti-fatigue effect on male KM mice, it provided the basis for the development of anti-fatigue products from Black Ginseng.

Black Ginseng; anti-fatigue; hepatic glycogen; lactic acid; lactic acid dehydrogenase

2016-07-15 基金項(xiàng)目：長(zhǎng)白山科學(xué)研究院資助項(xiàng)目(2016008)

史得君(1992—)，男，河北張家口人，在讀碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全性評(píng)價(jià)。陳兆雙、崔承弼為通信作者，

E-mail：cuichengbi@ybu.edu.cn，137632920@qq.com

1004-7999(2016)03-0204-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.004

R285.5

A