耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的OXA酶基因研究*

陸丹倩，芮勇宇，楊 秋，顧向明，鄧 沖，王巧媚，鄧聚輝，劉美嫦

(1.廣東省中山市中醫院檢驗科 528400；2.南方醫科大學南方醫院，廣州 510515；3.廣東醫科大學，廣東湛江 523770)

?

·論 著·

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的OXA酶基因研究*

陸丹倩1，芮勇宇2，楊 秋2，顧向明1，鄧 沖1，王巧媚1，鄧聚輝1，劉美嫦3

(1.廣東省中山市中醫院檢驗科 528400；2.南方醫科大學南方醫院，廣州 510515；3.廣東醫科大學，廣東湛江 523770)

目的 研究廣東省中山市中醫院分離耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)耐藥性、苯唑西林(OXA)酶基因及流行特性。 方法 收集廣東省中山市中醫院2012年7月至2013年12月臨床分離40株CRAB，采用紙片擴散法(K-B法)藥敏試驗，改良Hodge試驗篩查碳青霉烯酶；用聚合酶鏈式反應(PCR)法對β-內酰胺酶基因oxa-23、oxa-24、oxa-51和oxa-58進行擴增、序列分析。結果 40株CRAB對16種藥物中，對多黏菌素和米諾環素敏感性最高，耐藥率小于或等于5.0%；改良Hodge試驗陽性29株(占72.5%)；所有菌株均被檢測到含有oxa-51基因(占100.0%)，oxa-23基因為38株(占95.0%)，未檢出oxa-24和oxa-58基因。結論 oxa-51及oxa-23基因是廣東省中山市中醫院流行CRAB的主要基因型。

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌； 改良Hodge試驗； 聚合酶鏈式反應； 苯唑西林

近年來，鮑曼不動桿菌成為醫院感染的重要病原菌[1-2]，多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)菌株和耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)的分離比例逐年升高[3-4]。鮑曼不動桿菌的耐藥機制主要是產碳青霉烯酶水解酶，且碳青霉烯酶主要為D類苯唑西林(OXA) 酶[5]。OXA酶僅見于不動桿菌，其對β-內酰胺類抗菌藥物高度耐藥，能降低外膜蛋白表達或外排系統增強，產生多重耐藥。OXA酶主要包括4組：OXA-23型、OXA-24型、OXA-51型和OXA-58型[6]。筆者對廣東省中山市中醫院2012年7月至2013年12月臨床分離40株CRAB的耐藥現狀及其OXA酶基因攜帶情況進行研究，以了解其是否存在突變、突變對耐藥性的影響，摸清醫院CRAB的耐藥機制及流行克隆情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 40株CRAB來自廣東省中山市中醫院2012年7月至2013年12月住院患者送檢痰液、傷口分泌物、中段尿及血液標本，同一患者留取初次分離菌株。采用美國BD公司Phoenixtm 100全自動細菌鑒定儀對所有菌株進行分離。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均由國家衛生和計劃生育委員會臨床檢驗中心提供。

1.2 抗菌藥物 用于紙片擴散法(K-B法)藥敏試驗的抗菌藥物共17種：米諾環素、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、氨芐西林/舒巴坦、環丙沙星、頭孢吡肟、四環素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、阿米卡星、慶大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢西丁。藥敏紙片均為英國oxiod公司產品，MH平板均購自江門凱林公司。

1.3 儀器與試劑 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀器購自德國Eppendorf公司，凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。dNTPs、TaqDNA、聚合酶、蛋白酶K和 DNA Marker由大連瑞真生物技術有限公司提供。PCR引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉購自北京鼎國生物技術有限公司)。

1.4 碳青霉烯酶檢測 采用改良Hodge試驗，以0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌ATCC25922菌懸液涂布MH平板，中間貼10 μg/片美羅培南紙片，將測試菌用接種環以美羅培南紙片為中心向平板邊緣劃接種線(注意不要劃破平板表面)。35 ℃孵育18～24 h后觀察結果，美羅培南抑菌圈處出現變形者為待測菌產碳青霉烯酶。

1.5 OXA酶基因檢測 反應總體系為20 μL：含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP 終水平為200 μmol/L，上下游引物分別為0.2 μmol/L，模板DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，用滅菌去離子水加至20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，50～60 ℃退火并延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。具體退火溫度，見表1。電泳PCR反應結束后，取5 μL擴增產物與1 μL 6×Loading buffer上樣緩沖液混勻，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳30 min(緩沖液為0.5×TBE，電壓為5 V/cm)。通過凝膠成像儀讀取電泳結果。DNA Marker為DL2000。

表1 OXA酶基因PCR引物

2 結 果

2.1 標本來源及臨床分布 40株CRAB標本來源痰液29株(占72.5%)、傷口分泌物9株(占22.5%)、靜脈血1株(占2.5%)及中段尿1株(占2.5%)；臨床分布重癥監護室(ICU)18株(占45.0%)、內科10株(占25.0%)、骨科7株(占17.5%)、外科5株(占12.5%)。

2.2 耐藥性分析 40株CRAB對常用17種抗菌藥物的耐藥性分布，見表2。

表2 40株CRAB對17種抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3 碳青霉烯酶檢測 改良Hodge試驗結果，40株CRAB的改良Hodge試驗結果顯示，陽性29株(占72.5%)呈矢狀生長，陰性11株(占27.5%)。

2.4 OXA酶基因檢測結果 40株CRAB中，40株oxa-51陽性(占100.0%)，38株oxa-23陽性(占95.0%)，未檢出oxa-24和oxa-58。電泳結果，見圖1。

注：圖1A為oxa-51電泳結果，圖1B為oxa-23電泳結果。

3 討 論

目前，鮑曼不動桿菌臨床檢出率逐年升高，以呼吸道感染最常見[4,7-8]。本研究顯示，其以呼吸道感染為主(占72.5%，29/40)，其次為傷口感染(占22.5%，9/40)、血流感染(占2.5%，1/40)和泌尿系感染(占2.5%，1/40)。提示鮑曼不動桿菌在呼吸系統容易引起感染或定植，難以清除。分布科室主要是以ICU為主[9-10]，可能與ICU患者住院時間長、病情嚴重、機體免疫功力差、大量使用廣譜抗菌藥物及各種侵入性檢查和治療等有關。

耐藥性分析顯示，鮑曼不動桿菌耐藥情況嚴重，呈多重耐藥和泛耐藥。目前，廣東省中山市中醫院40株CRAB對多黏菌素B、米諾環素敏感性最高，耐藥率分別為2.5%、5.0%，對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20.0%，故上述3種藥物可作為CRAB感染的治療選擇。其他13種抗菌藥物耐藥率為55%～100%，表明CRAB耐藥現象嚴重，臨床應嚴格控制抗菌藥物應用，減少鮑曼不動桿菌感染。

鮑曼不動桿菌產碳青霉烯酶是其主要耐藥機制。碳青霉烯酶主要包括A、B和D等3類酶，主要為產D類酶(OXA 酶)，僅見于不動桿菌。國內流行耐藥基因為oxa-23和oxa-51[11-13]。本試驗檢測40株CRAB的OXA酶基因，結果顯示所有菌株均攜帶有oxa-51(占100.0%)，38株oxa-23陽性(占95.0%)，未檢測到oxa-24和oxa-58，說明廣東省中山市鮑曼不動桿菌的基因型是以oxa-51和oxa-23為主，與國內流行相符。oxa-51是鮑曼不動桿菌的重要標志，也是鮑曼不動桿菌的固有基因[14]，可用以區別于其他不動桿菌屬；水解碳青霉烯酶類藥物能力較弱，不能水解頭孢菌素類藥物[15]。oxa-23能介導細菌耐碳青霉烯類藥物，是目前流行傳播最廣的D類碳青霉烯類基因。40株CRAB中有29株改良Hodge試驗表型檢測為陽性(占72.5%)，11株表型檢測為陰性(占27.5%)，可能由于基因表達水平受諸多因素影響，低水平表達時表型無法檢測而呈陰性。

本研究表明，廣東省中山市中醫院CRAB對常用抗菌藥物耐藥情況嚴重，最主要碳青霉烯酶基因型為oxa-23，存在克隆傳播流行。因此，醫院應規范臨床合理使用抗菌藥物，加強對本地區CRAB耐藥性及耐藥機制的監測及關注，加強手衛生、患者隔離、環境清潔消毒等感控措施，其對指導臨床合理用藥、避免CRAB醫院感染暴發流行具有重要意義。

[1]汪復,朱德妹,胡付品,等.2012年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2013,13(5):321-330.

[2]胡付品,朱德妹,汪復,等.2013年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2014,14(5):365-374.

[3]楊均均,黃文祥,史芳靜,等.耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌流行特征及耐藥基因分析[J].中國抗生素雜志,2012,37(5):343-347.

[4]吳偉元,金曉菲,吳詩品,等.深圳市人民醫院近8年耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌感染特征及其克隆變遷[J].中華醫學雜志,2015,95(8):585-590.

[5]王輝,孫宏莉,廖康,等.北京和廣州地區四家醫院不動桿菌碳青霉烯酶基因型研究[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(6):636-641.

[6]Jan WJ,Hoiby N.OXA-type carbapenemases[J].J Antimiccrob Chemother,2006,57(3):373-383.

[7]孫晴,張正銀.臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌同源性分析及常見耐藥基因檢測[J].中國感染與化療雜志,2015,15(1):28-31.

[8]王娟,宋立強,王磊,等.下呼吸道感染廣泛耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性分析和部分碳青霉烯酶基因檢測[J].國際呼吸雜志,2015,35(2):87-90.

[9]毛璞,李建春,邱桂霞,等.重癥監護病房耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌耐藥機制研究[J].中國感染與化療雜志,2015,15(3):253-256.

[10]葉繼輝,李超芬,丁群力.亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染危險因素分析[J].浙江醫學,2015,37(4):300-303.

[11]楊正海,李小寧.碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌OXA酶基因研究[J].中國抗生素雜志,2015,40(3):203-207.

[12]李茜,李慶淑,李智,等.青島兩所醫院鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因及同源性分析[J].中國感染控制雜志,2015,14(7):437-442.

[13]劉超梅,李雪梅,陳志英,等.呼和浩特地區耐亞胺培南鮑曼不動桿菌耐藥性及OXA 基因檢測[J].中國感染控制雜志,2015,14(5):289-293.

[14]鐘敏,黃文芳.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌產OXA酶的研究進展[J].中國微生態學雜志,2013,25(1):122-125.

[15]Brown S,Young HK,Amyes SGB.Characterization of oxa-51,a novelclass D carbapenemase found in genetically unrelated clinical strains of Acinetobacter baumannii from Argentina[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(1):15-23.

Research on OXA carbapenemases gene of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii*

LUDanqian1,RUIYongyu2,YANGQiu2,GUXiangming1,DENGChong1,WANGQiaomei1,DENGJuhui1,LIUMeichang3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhongshan,Guangdong528400,China;2.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China;3.GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang,Guangdong523770,China)

Objective To investigate the drug resistance of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB) clinically isolated from hospital,OXA carbapenemases gene and epidemiological characteristics.Methods A total of 40 clinically isolated strains of CRAB were collected in this hospital from July 2011 to December 2012.oxa-23,oxa-24,oxa-51 and oxa-58 were amplified and sequenced by adopting the PCR method.Results Forty strains of CRAB had the highest sensitivity to polymyxin B and minocycline among 16 kinds of drugs,with the resistance rate less than 5.0%;29 strains(72.5%) were positive in the modified Hodge test;the oxa-51 gene was detected in all strains,accounting for 100.0%,in which 38 strains(95.0%) contained oxa-23 gene,no oxa-24 and oxa-58 genes were detected.Conclusion oxa-51 and oxa-23 genes are the main genotypes of epidemic CRAB in Zhongshan Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine.

CRAB; modified Hodge test; PCR; OXA

廣東省中山市科技局基金資助項目(2014A1FC052)。

陸丹倩，女，副主任技師，主要從事臨床微生物學方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.006

A

1673-4130(2016)22-3108-03

2016-04-11

2016-06-17)