探討細菌16S rRNA基因檢測對新生兒敗血癥早期診斷的意義

賈永鋒　朱金梅

探討細菌16S rRNA基因檢測對新生兒敗血癥早期診斷的意義

賈永鋒①朱金梅②

目的：探討細菌16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)基因檢測對新生兒敗血癥早期診斷的意義。方法：對126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標本進行16S rRNA基因聚合酶鏈反應(PCR)檢測，并同時做血培養，比較分析兩種方法檢測細菌病原體的快速性、敏感性和特異性。結果：126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標本經血培養檢測陽性率為13.8%(17/126)；經PCR檢測陽性率為22.2%(28/126)，PCR檢測陽性率明顯高于血培養檢測陽性率，差異顯著(x2=10.234，P=0.004)。以血培養為“金標準”，PCR檢測靈敏度為88.2%(15/17)、特異度為88.1%(96/109)。從操作時間分析，血培養和PCR檢測的平均時間分別為(28.9±4.3)h和(7.5±1.2)h，PCR檢測速度明顯快于血培養。結論：細菌16S rRNA基因PCR檢測方法速度快、敏感性高且特異性強，不受抗生素的干擾，可為新生兒敗血癥的早期診斷提供可靠依據。

16S rRNA基因；新生兒敗血癥；早期診斷；聚合酶鏈反應

[First-author’s address] Neonatology Department, Shangluo Central Hospital, Shangluo 721000, China.

新生兒敗血癥(septicemia of newborn)是新生兒常見疾病之一，指新生兒期致病菌經各種途徑侵入其血循環系統，并在其中生長繁殖、產生毒素，最終造成全身性的炎癥反應[1]。該病的病因較復雜，常見致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白桿菌及B組鏈球菌等，主要通過宮內感染、產時感染及產后感染[2]。新生兒時期該病的發生率和病死率均較高，但因缺乏典型的臨床表現和體征，往往病情進展迅速，嚴重威脅新生兒的生命，故早期診斷明確病原菌與及時應用有效抗菌藥物亦非常重要。

目前，臨床上的血培養檢測細菌常用方法由于檢測時間長，且陽性率較低，難以達到早期診斷的目的[3]。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術已被廣泛用于檢測細菌等微生物，并成為細菌16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)基因檢測的重要方法[4-7]。為此，本研究對126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標本進行細菌16S rRNA基因PCR檢測，旨在探討新生兒敗血癥快速、可靠的早期診斷方法，為臨床提供診斷依據。

1　資料與方法

1.1一般資料

參照中華醫學會兒科分會新生兒學組制定的《新生兒敗血癥診療方案》[8]診斷標準，選取2014年1月至2015年1月商洛市中心醫院新生兒科擬診斷的126例新生兒敗血癥患兒，其中男患兒79例、女患兒47例；年齡2 h至30 d。分別對所有患兒的血標本進行細菌培養及細菌16S rRNA基因檢測，抽取每例患兒2 ml靜脈血做血培養，同時抽取1 ml靜脈血做細菌16S rRNA基因檢測。同期抽取25名正常新生兒相同血標本做質量控制，對照菌株為：大腸埃希菌(ATCC25923)、金黃色葡萄球菌(ATCC25922)由細菌室提供，分別選擇所有細菌、革蘭氏陰性細菌及革蘭氏陽性細菌的16S設計合成三對共同引物，由上海細胞生物學研究所癌基因室合成。本研究使用BacT/ALERT 120全自動血培養系統進行細菌培養。

1.2納入與排除標準

(1)納入標準：①符合診斷標準中擬診斷的新生兒敗血癥患兒；②未感染其他血液性疾病的患兒。

(2)排除標準：①檢測前已確診的新生兒敗血癥患兒；②抽取或檢測過程中受污染的血標本。

1.3儀器設備

采用FTC-2000A型熒光定量PCR儀(西安賽維斯生物科技有限公司)；DYY-8C穩流穩壓電泳儀(成都明萱電子科技有限公司)：2～600 V、1～200 mA，穩流、穩壓且連續可調，數顯，雙輸出，可同時帶2個電泳槽，用于常壓電泳；JD-801專業數碼凝膠成像與分析系統(南京瞰森儀器有限公司)；BacT/ALERT 120全自動血培養系統(上海祥和科學技術有限公司)。

1.4操作方法

1.4.1血標本DNA提取

(1)抗凝全血加PBS液，離心、棄上清。使用TE緩沖液[Tris鹽酸緩沖液中加入乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)制成]、蛋白酶K溶液及10%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液懸浮沉淀，于56 ℃水浴5 h。冷卻至4℃時，加入等體積的Tris-HCl(pH值8.0)酚，顛倒混勻，以10000 r/min的速度離心15 min，吸取上層水相。

(2)加入等體積氯仿和(或)異戊醇，顛倒混勻，4℃10000 r/min離心10 min。取上層水相加入10%體積的3 mol/L的乙酸鈉(pH值5.2)，混勻后，加入2.5倍體積的100%的乙醇，顛倒混勻，-20 ℃孵育過夜，4℃ 10000 r/min離心20 min，棄上清。

(3)去盡乙醇，加入70%的乙醇1 ml，混勻，4 ℃5000 r/min離心10 min，棄上清，室溫干燥10 min，至白色沉淀物周邊變白，加入20 μlTE緩沖液溶解，-20 ℃冰箱保存。

1.4.2細菌DNA提取

挑取菌落用TE緩沖液制成0.5 ml的懸浮液，加入100 μl溶菌酶溶液，于37 ℃孵育30 min，再加入10%的SDS液150 μl、20 μl蛋白酶K溶液，充分混勻后，于56 ℃孵育3 h至沉淀物完全溶解，震搖數次使之混勻。后續步驟同血標本DNA的提取，同時以200 μl的TE緩沖液按上述方法提取后作為PCR操作的陰性對照。

1.4.3PCR反應

用引物擴增對照菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，并用DNA提取過程中同步操作的TE緩沖液作為陰性對照，10×PCR緩沖液5 μl，4種dNTP混合物4μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，水生嗜熱菌(thermus aquaticus，Taq)DNA聚合酶0.5μl，模板2 μl，加入37.5 μl已消毒過濾的去離子水，混勻后離心數秒后按預變性95 ℃ 10 min、94 ℃ 45 s、60 ℃ 30 s以及72 ℃ 60 s參數擴增，共35個循環，于72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保存待檢。

1.4.4PCR結果判斷

使用瓊脂糖凝膠電泳判斷PCR產物中有無DNA。將混合物及DNA Marker加至樣品槽中，80 V電泳30 min，凝膠置于凝膠成像系統中拍照并保留記錄，370 bp處有熒光者為陽性。

1.5觀察指標及評價標準

觀察血標本經血培養與PCR檢測后的陽性例數、兩種方法的檢測時間；計算兩種方法的檢測陽性率；以傳統檢測的血培養為評價“金標準”，計算PCR檢測的靈敏度和特異度。

1.6統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件對所有數據進行分析處理，計量資料用均數±標準差(x-±s)表示，計數資料用率(%)表示。兩種方法的檢測結果采用配對x2檢驗進行差異性比較，a=0.05為檢驗水準，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　 結果

(1)對126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標本進行血培養檢測，其中陽性率為13.8%(17/126)；經PCR檢測，陽性率為22.2%(28/126)，PCR檢測陽性率明顯高于血培養檢測陽性率，差異有統計學意義(x2=10.234，P＜0.05)。以血培養為“金標準”，PCR檢測靈敏度和特異度分別為88.2%(15/17)和88.1%(96/109)，血培養與PCR法兩者的陽性符合率為11.9%(15/126)，見表1。

表1　血培養與PCR方法檢測結果比較(例)

(2)兩種方法檢測28例正常對照者的血標本均為陰性。從操作時間分析，血培養和PCR檢測的平均時間分別為(50.9±4.3)h和(7.5±1.2)h，PCR檢測速度明顯快于血培養；PCR產物的核酸電泳成像如圖1所示。

圖1　PCR產物核酸電泳成像圖

3　討論

16S rRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中，16S rRNA具有高度的保守性和特異性，且其基因序列足夠長(包含約50個功能域)。隨著PCR技術的出現及核酸研究技術的不斷完善與發展，16S rRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。相對于常規的血培養技術，PCR技術除了具有敏感性高、特異性強及檢測時間短的優點，其最大的優勢是檢測結果不受血標本中存在的各種抗菌藥物的干擾[9-12]。因此，該技術不僅能將常規血培養無法檢測的細菌識別出來，實現對病原菌快速、準確地進行分類鑒定和檢測，還可以用于疑似某種感染性疾病并已采用某些抗菌藥物治療的患者[12]。

臨床上新生兒敗血癥早期往往缺乏特異的臨床癥狀及體征，主要表現為非特異性癥狀，包括精神差、反應不佳、哭聲減弱無調以及奶欲減退等。因此，對該病的早期診斷必須依靠一定的檢測技術快速準確地找到病原菌。目前，臨床上診斷新生兒敗血癥除血培養外，還有白細胞計數、血小板計數、C反應蛋白以及降鈣素原等非特異指標檢測，但這些非特異指標的檢測因本身條件的限制而存在缺陷，不能做到快速準確地早期診斷。通常作為診斷“金標準”的血培養因陽性率較低，且檢測時間長也不能達到早期診斷的目的，故本研究采用細菌16S rRNA基因PCR檢測方法，對126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標本進行檢測，其陽性率明顯高于血培養檢測的陽性率，表明PCR檢測技術診斷陽性率較高。

本研究檢測結果顯示，有13份血標本PCR陽性而血培養陰性，原因可能為血培養所用血標本細菌濃度太低，導致檢測結果為假陰性；入院前患者服用的抗生素抑制了細菌生長，導致血培養結果為陰性。有2份血標本血培養陽性而PCR陰性，可能原因為：血標本本身無細菌，因血培養時被細菌污染而導致血培養為假陽性；血標本中含有PCR反應酶的抑制劑導致PCR陰性。本研究結果表明，以血培養為“金標準”，PCR檢測技術靈敏度和特異度均較高。此外，從操作時間分析，PCR檢測速度明顯快于血培養。而本研究結果與國內相關學者對16S rRNA基因PCR法的研究報道結果基本一致[13-16]。

綜上所述，細菌16S rRNA基因PCR法不僅具有速度快、敏感性高、特異性強以及檢測時間短的優點，且不受抗生素的干擾，臨床上可為新生兒敗血癥早期診斷提供快速和準確的病原學依據。

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Research significance about the detection of 16SrRNA gene in the early diagnosis of neonatal septicemia

JIA Yong–feng, ZHU Jin-mei// China Medical Equipment,2016,13(11):90-93.

Objective: To study the significance about the detection of 16SrRNA gene in the early diagnosis of neonatal septicemia. Methods: 126 cases with suspecting neonatal septicemia meningitis were collected. Every sample was detected with blood culture and 16SrRNA gene polymerase chain reaction (PCR) test, comparing testing rapidity, sensitivity and specificity of bacterial pathogens of two kinds of methods. Results: The tests positive rate of 126 cases suspecting neonatal septicemia with blood culture was 13.8% (17/126). PCR detection positive rate was 22.2% (28/126). PCR detection positive rate was significantly higher than blood culture positive rate, and the difference was statistically significant (McNemar=10.234, P=0.004). Taking blood culture as the “gold standard”, the sensitivity of PCR detection was 88.2% (15/17) and specificity was 88.1% (96/109). Analyzing the operating time, the average test time of blood culture and PCR detection was (28.9±4.3)h and (7.5±1.2)h respectively. The test speed of PCR detection was faster than blood culture. Conclusion: PCR detection method of the bacterial 16SrRNA gene is fast, and has high sensitivity and strong specificity. It is not affected by the antibiotics, and can provide reliable basis for the early diagnosis of neonatal septicemia.

16SrRNA gene; Neonatal septicemia; Early diagnosis; Polymerase chain reaction

賈永鋒,男,(1973- ),本科學歷，副主任醫師。商洛市中心醫院新生兒科，從事新生兒診療工作。

1672-8270(2016)11-0090-04

R722.131

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.027

①商洛市中心醫院新生兒科 陜西 商洛 721000

②重慶市中醫院檢驗科 重慶 400021

2016-08-29