膠乳增強免疫比濁法檢測尿液中α1-微球蛋白的含量

蔣澤軍　蔣慶姣　冼慶勇*　劉云鵬　何金洋　韋秋云

膠乳增強免疫比濁法檢測尿液中α1-微球蛋白的含量

蔣澤軍①蔣慶姣①冼慶勇①*劉云鵬①何金洋①韋秋云①

目的：對自主研制的尿α1-微球蛋白(α1-MG)檢測試劑盒進行綜合性能評價，并與進口試劑進行臨床對比。方法：采用尿α1-MG檢測試劑盒，對收集的101例腎病患者晨尿進行α1-MG的含量檢測。將α1-MG的多克隆抗體包被在膠乳微粒上，添加相應的穩定劑得到試劑R2，采用適合的緩沖體系、增敏劑及穩定劑得到試劑R1。評價由試劑R1和試劑R2組成試劑盒的定標曲線、穩定性、干擾試驗及回收率等檢測性能。結果：試劑盒的測量范圍在2.0～160 mg/ L，回收率為94.0%～106.0%，對不同濃度的臨床樣本測試20次，其變異系數(CV)＜5.0%；與日本進口試劑相比較，測試臨床標本101例，其相關系數r2＝0.9854。結論：該試劑盒具有良好的準確性和重復性，線性范圍寬，符合臨床檢測需要，可用于尿液中α1-MG的含量檢測。

免疫；比濁；α1-微球蛋白；尿液；膠乳

[First-author’s address] Reagent R&D Center, Guilin URIT Medical Electronics co., LTD, Guilin 541004, China.

尿液檢驗對于泌尿系統感染性和非感染疾病的篩查、輔助診斷、病程和療效監測，以及對其他系統疾病(如糖尿病、高血壓、遺傳性疾病及藥物不良反應等)的篩查，療效或并發癥的監測都具有重要意義[1-4]。臨床上有些藥物的排泄通過腎小球濾過和近端腎小管分泌，這些藥物的使用增加了腎功能下降和慢性腎臟疾病的風險，從而可能引起尿液中特種蛋白含量的增加[5-6]。

尿液蛋白的檢測多采用化學比色法，隨著科技的進步，蛋白種類得以分類，并具有相應的臨床意義[7-9]。特種蛋白的免疫測定得到快速發展，是利用抗原-抗體的特異反應檢測臨床樣本中微量蛋白的分析方法，而此種方法最大的特點是特異性強、靈敏度高，以及使用的簡便和快速[10-11]。

尿液α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)的相對分子量為27000，是一種相對較小的糖蛋白，等電點(isoelectric point，PI)為4.5～5.5[12]。該蛋白產生恒定，在機體內廣泛分布，易通過腎小球濾過膜，其中絕大部分被腎小管重新吸收，且不受pH值變化的影響。尿液α1-MG的升高，常提示腎小管與間質損害[13-14]。尿液α1-MG測定有利于鑒別上、下尿路感染、腎性與腎后性蛋白尿及血尿[15]。為此，本研究自主研制尿液α1-MG的檢測試劑盒并對其進行綜合性能評價，為臨床疾病診斷提供科學依據。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2014年8-9月桂林醫學院附屬醫院收治的101例腎病患者，其中男性57例，女性44例；年齡23～74歲；均為腎臟疾病或其他疾病引起的腎功能損害患者，收集患者晨尿進行α1-MG含量檢測。

1.2儀器與試劑

(1)采用7180型全自動生化分析儀(日本，HITACHI)；TG21KR型高速離心機(長沙東旺實驗儀器有限公司)；XC-CD型細胞粉碎機(寧波市先倡電子科技有限公司)。

(2)α1-MG多克隆抗體(丹麥)；聚苯乙烯膠乳、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、表面活性劑及穩定劑，日本進口α1-MG檢測試劑盒；本研究研制的α1-MG檢測試劑盒。

1.3試劑盒制備方法

將1 ml的α1-MG多克隆抗體、0.5 ml膠乳微球(固含量5%)及2%的碳化二亞胺20 μl加入到2 ml濃度為0.05 mol/L的PBS緩沖液中，放置于25 ℃環境下攪拌30 min，以15000 r/min的轉速離心30 min分離后加入分散緩沖液，再加入阻斷劑封閉膠乳，超聲10 min后膠乳均勻懸浮，即為R2試劑；R1為試劑自配：在100 ml的濃度為0.15 mol/L的PBS緩沖體系中加入0.1 g表面活性劑、0.25 g聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000及0.08 g穩定劑等。

1.4檢測方法

采用全自動生化分析儀測試試劑性能及臨床樣本，參數設置：R1試劑200 μl，R2試劑50 μl，樣本、標準樣本及水均為12 μl，檢測主波長為600 nm，副波長為700 nm。

2　結果

2.1檢測性能

使用自制的R1和R2試劑及外購的α1-MG校準品，用7180型日立全自動生化分析儀定標測試，定標曲線如圖1所示。由曲線可見自制試劑盒在對α1-MG的檢測反應良好，并呈現較好的線性關系，r2=0.998。

圖1　α1-MG的定標曲線圖

2.2穩定性分析

將自制試劑盒的R1和R2密封放置于溫度為40 ℃，濕度為80%的恒溫恒濕箱中，負荷7 d后測試，對比測試負荷前后試劑盒的檢測性能。結果顯示，負荷后試劑盒的吸光度值略有降低，但α1-MG校準品的濃度在2.0～160 mg/L的范圍時，降低的吸光度值＜10%，且仍呈現良好的線性關系(r2=0.998)，如圖2所示。

圖2　α1-MG檢測試劑盒負荷前后的定標曲線對比圖

2.3精密度分析

分別選取3個不同水平(低值、中值、高值)的尿液樣本，連續測試20次，計算測量值、標準偏差及相對標準偏差，其測試變異系數(coefficient variation，CV)值均在5%以內，見表1。

表1　精密度分析測試結果

2.4干擾測試

分別選用2個不同水平(高值、低值)的混合尿液樣本，加入不同濃度的干擾物，以等體積的生理鹽水作為無干擾樣本，同時測定這些標本的濃度，結果以干擾程度10%作為該系統對干擾物的最高限。結果顯示，在血紅蛋白≤10 g/L、膽紅素≤0.6 g/L、維生素C≤0.6 g/L以及肌酐≤10 g/L時，對于測定尿液中α1-MG無影響。

2.5加標回收率

將已知α1-MG濃度的混合尿液樣本分成3等份，分別添加一定量的α1-MG校準品，進行測試3次，平均回收率為94.0%～106.0%，相對標準偏差＜5%，符合實驗要求，見表2。

表2　加標回收率測試結果

2.6臨床對比測試

對101例臨床尿液樣本分別使用自制α1-MG試劑與日本進口試劑進行臨床對比測試，其結果顯示呈現較好的相關性(r2=0.9854)，如圖3所示。

圖3　自制α1-MG試劑與日本進口試劑臨床測試對比圖

3　討論

尿液特種蛋白的檢測被認為是反映早期腎損傷的靈敏指標，人體內α1-MG的產生恒定，尿液中α1-MG的排出量較少受腎外因素的影響，尿液α1-MG檢測可為腎小管損傷診斷提供參考依據，被認為是較特異的腎功能損傷診斷試驗[16-18]。因此，α1-MG檢測試劑盒的綜合性能在臨床測試中尤為重要，本研究中尿液α1-MG檢測試劑盒在2～160 mg/ L范圍內，α1-MG的濃度與吸光度值呈良好的線性關系，r2=0.998。此外，試劑盒密封放置于溫度為40℃，濕度為80%的恒溫恒濕箱中負荷7 d，試劑盒與尿液中α1-MG的反應仍具有較高的吸光度，且呈現良好的線性關系，r2=0.9982。由此可見，本研究中的α1-MG試劑盒具備較好的穩定性。

本研究對該方法的檢測試劑盒進行了加標回收率實驗，在已知α1-MG濃度(18.5 mg/L)的尿液樣本中添加不定量的α1-MG校準物，分別添加10 mg/L、20 mg/L及35 mg/L，重復3次測試，計算回收率及相對標準偏差，其回收率為94.0%～106.0%，相對標準偏差＜5%。同時，對尿液中較常見的干擾物質進行干擾試驗，包括10 g/L血紅蛋白、0.6 g/L膽紅素、0.6 g/ L維生素C以及10 g/L肌酐，均對本測試方法無影響。試驗結果表明，本研究中的α1-MG檢測試劑盒在尿液中的檢測應用具有較好的可行性。

使用自制的α1-MG檢測試劑盒和日本進口的α1-MG檢測試劑盒分別對101例臨床樣本進行平行檢測，其結果顯示，臨床樣本的α1-MG含量均在試劑盒的檢測范圍內，兩種方法的測試結果對比，呈現良好的相關性，r2=0.9854。在本研究α1-MG試劑盒精密度實驗中，分別對3個不同水平的尿液樣本進行重復測試20次，其標準偏差控制在0.21～1.76范圍內，其CV值＜5%，表明本研究的試劑盒能夠滿足臨床測試的需要。

綜上所述，本研究利用膠乳增強免疫比濁法研制了檢測尿液中α1-MG的試劑盒，并對試劑盒的檢測性能、精密度、穩定性、干擾試驗、回收率以及臨床對比等進行分析測試。結果表明，本研究研制的尿液α1-MG檢測試劑盒，測試性能良好，能夠滿足臨床檢測的需要，可為腎臟疾病患者的臨床診斷和治療提供更多可靠的參考依據。

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Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay method for the determination of α1-microglobulin in urine

JIANG Ze-jun, JIANG Qing-jiao, XIAN Qing-yong, et al// China Medical Equipment,2016,13(11):47-50.

Objective: The comprehensive performance of self-developed urine alpha 1 -microglobulin (α1-MG) testing kit was evaluated and compared with imported reagents kit for clinical samples. Methods: The method is detecting the content of trace α1-MG in urine by the test kit, which included reagents R2 and R1. The reagents R2 of the test kit contained stabilizer and latex particles, which is packaged on the polyclonal antibody of α1-MG. The main component of the reagents R1 of the test kit was suitable buffer system, sensitization agent and stabilizer. Evaluation of the detection performance of the test kit was completed, including calibration curve, stability, interference test, and recovery rate, detecting the content of urinary α1-MG in 101 patients with kidney disease. Results: The measurement range of the test kit is 2.0～160 mg/L, and the recovery is 94.0%～106.0%. Testing the different concentrations of clinical samples(n=20), the coefficient of variation is less than 5.0%. Compared with the imported reagent from Japan, the correlation coefficient of 101 clinical samples is 0.9854. Conclusion: The test kit with fine repeatability, veracity and wide measurement range can be used for clinical detection of α1-MG in urine.

Immunoassay; Turbidimetric; α1–microglobulin; Urine; Latex

蔣澤軍,男,(1986- ),碩士，工程師。桂林優利特醫療電子有限公司試劑研發中心，從事尿液特種蛋白含量分析及尿質控品研究。

1672-8270(2016)11-0047-04

R446.6

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.014

①桂林優利特醫療電子有限公司試劑研發中心 廣西 桂林 541004

xianqingyong@uritest.com.cn

2016-05-10